植物重金属耐受分子机理的研究进展

谭九洲，黄迎波(湖南出入境检验检疫局，湖南长沙410004)

土壤重金属是指由于人类活动将金属加入到土壤中，致使土壤中重金属明显高于原生含量、并造成生态环境质量恶化的现象。污染土壤的重金属主要包括汞、镉、铅、铬和类金属砷等生物毒性显著的元素。重金属污染物在土壤中移动性很小，不易随水淋滤，不为微生物降解，通过食物链进入人体后，潜在危害极大。当土壤中重金属离子含量超过其对重金属离子的自净作用时，将对植物代谢和生长发育产生影响。但重金属胁迫也使某些植物产生了相应耐受性，包括对重金属的解毒和对重金属的转运两个过程。笔者对近几年开展植物耐重金属胁迫的分子机理方面的研究进展作一综述，从而从分子水平揭示植物应对重金属胁迫响应中关键蛋白功能、表达调控，以期为今后开展提高植物重金属耐受性的基因工程研究打下基础。

1 植物蛋白的变化与抗重金属能力之间的关系

蛋白质组分析是鉴定植物抗重金属能力提升过程的强有力的方法［1-3］。通过这种方法，已经在多种植物中发现多种重金属敏感蛋白。在这些重金属敏感蛋白中，数量最多的一类是涉及抗氧化保护蛋白。氧化反应一般被认为是植物受到重金属危害所生成的结果［4］。抗氧化保护相关蛋白中67%表达量在受重金属处理后上调，而且上调程度又随受重金属处理的时间长短而不同。第二大类蛋白是那些与蛋白折叠相关的蛋白，如热激蛋白、伴侣蛋白和蛋白质二硫键异构酶，它们在受重金属处理后一般表现为上调。这表明，蛋白质折叠的维持和稳定性对植物重金属耐受性非常重要。第三大类重金属敏感蛋白是病程相关蛋白。在17个已知的蛋白中有13个表现为上调。这表明植物受重金属胁迫和生物胁迫所发生的应激反应之间存在紧密的联系。发现有17个参与信号转导的蛋白在重金属处理后也表现出差异。信号蛋白中的受体激酶和细胞壁相关蛋白激酶在受镉、铜和铝处理后表现为上调，可能是一个重要的金属传感系统组件。其他两类重金属敏感蛋白分别是:参与脂质代谢的蛋白，蛋白和离子转运蛋白。它们在重金属处理后通常都上调，因此它们有可能成为重金属监测系统中的组成部分。脂质代谢蛋白表达上调可能是对重金属在脂质双层组合物的负面影响下的一种直接反应。大多数参与蛋白和离子转运的蛋白在应对重金属响应时表现出了差异，因此它们就是调节液泡前体舱室和液泡之间的胞内囊泡运输的质子泵［5］。这种运输途径可能与细胞内的重金属转运有关。

2 重金属吸收与转运

重金属离子的吸收和在细胞中体内的平衡是由具体转运载体和金属泵控制［6］，它们都是典型的膜蛋白，属于不同的植物金属转运蛋白家族，可以在组织水平(例如从叶肉向表皮细胞运输金属离子)或在器官水平(例如从根部向地上部运输金属离子)起作用。这些蛋白质控制金属离子运输穿过质膜、液泡膜，和其他的内膜细胞器等亚细胞结构［7-8］。像HMAS(重金属相关蛋白)和NRAMPs(抗性相关巨噬细胞蛋白)这些蛋白是通过基因工程提高重金属的耐受性的好对象。重要的是，这类蛋白的过表达既加强植物对重金属的耐受性，又没有对植物生理代谢造成不利影响［9-10］。金属转运蛋白能提高植物重金属耐受性的能力主要源自于它们能增加植物把重金属封存在液泡中的能力，并且形成重金属螯合物，从而大大降低了其对植物所造成的毒性。

2.1 锌铁转运蛋白家族(ZIP)ZIP转运蛋白，优先参与铁和锌的吸收、富集［11］，也可能参与了对镉的响应［12］和对镍的耐受性［13］。关于这个家族的各个成员，拟南芥中有3个IRT(铁转运蛋白)的基因，控制不同的金属离子转运。锌处理剂量的增加引起IRT1、IRT2和IRT3这3个基因的表达，这表明它们可能参与控制细胞内锌–铁的平衡。拟南芥、圆叶南芥IRT1和IRT2基因的表达量与其对重金属的超富集能力呈负相关［14］。有趣的是，这些基因的过表达不明确能否提高重金属耐受性。例如，拟南芥IRT1基因的过表达引起铁、锰、钴和锌大量富集，从而对植株造成不利影响［15］。有趣的是，拟南芥IRT3表达对铁和锌积累的影响不同:锌在转基因株系的茎叶中富集，而铁则在根中富集［16］。另一种参与锌的特异性吸收和转运的蛋白(ZNT)，在天蓝遏蓝菜中控制锌的长距离运输［17］。与野生型相比，过表达 NcZNT拟南芥根部富集更多的锌(而茎、叶富集程度比根弱)。然而，过表达IRT1基因转基因株系［15］，比野生型更易受到高剂量的锌毒害［17］。这些研究结果表明，这类蛋白质的表达必须严格控制，因为它们的表达可能对离子平衡造成负面影响。

2.2 重金属转运蛋白(HMA)来自P1B-ATPase家族HMA参与金属离子从细胞质穿过细胞膜，从而使离子从根部向地上部转运［18］。然而，最近的一项研究，使用尺寸排阻色谱法和电感耦合等离子体质谱分析表明，AtHMA4还能螯合锌离子和镉离子［19］。这些转运蛋白在不同的同源或异源系统中过表达增加其重金属耐受性，这意味它们可能有非常重要的生物应用价值。它们的离子特异性表现为广谱，对锌、镉和钴都有抗性。拟南芥AtHMA4过表达，其根系在高浓度锌、镉和钴下的生长增强［9］。这一结果得到在AtHMA4突变植物对锌和镉的敏感性增加试验的确证［20］。可以通过HMAS与金属硫蛋白共同过表达来控制其离子特异性和在重金属耐性中所起的作用。这种方法既增加植物对镉的耐受性并提高镉和锌从根部向地上部转运的能力，又没有影响对镉、锌的吸收和锌的耐受性［21］。重金属超富集植物圆叶南芥AhHMA4同族体使其产生对锌和镉的耐受性，并且也参与了锌由根向地上部的转运与积累［22］。该基因在番茄根中超表达能维持锌–铁的平衡，因为叶中锌过量加剧了铁的缺乏，从而激活铁的吸收［23］。

2.3 阳离子扩散促进者(CDF)CDF蛋白家族成员的功能是控制锌、镉、钴和镍的逆向输送，以定位于液泡膜。AtMTP1是Zn2+/H+逆向转运蛋白，对锌有高度特异性，依赖V-ATPase将锌从细胞质转运到液泡中去［24］。AtMTP1超表达提高拟南芥对锌的耐受性，而AtMTP1突变体对锌更加敏感［25］。最近报道表明，AtMTP1中一段特定的氨基酸序列负责其对锌特异选择和锌含量的鉴定。在酵母中将这段特定的序列进行点突变就能产生对钴和镉的耐受性［26］，这就意味着通过对这个蛋白进行基因工程改造来扩大其金属离子的特异性。拟南芥AtMTP3过表达使其产生对锌的耐受性，并促进锌在根和莲座叶上富集［27］。AtMTP11是定位在液泡前体，与锰的耐受性和富集相关的蛋白［28］。其他植物物种的CDF家族蛋白，如OsMTP1定位到质膜，它们有更广谱的离子特异性。OsMTP1在酵母中过表达增加其对锌、镍和镉的耐受性［29］。东南景天SaMTP1在两种生态型差异表达使得它们的重金属超富集能力不同，这表明了SaMTP1蛋白能提高对重金属耐受性。不同生态型SaMTP1表达差异较大，超富集生态型SaMTP1表达的量比其非超富集的生态型高出80倍［30］。遏蓝菜TgMTP1在拟南芥中表达时能让拟南芥产生对锌的耐受性，它提高了锌转运蛋白(ZIP3、ZIP4、ZIP5和ZIP9)在地上部和根系组织的表达［31］，这表明它可能是ZIP转运蛋白家族这些成员的一个上游激活子。

2.4 自然抗性相关巨噬细胞蛋白(NRAMP)转运 NRAMP基因家族编码介导多种金属转运的膜蛋白。通过过表达的研究表明，AtNRAMP1、AtNRAMP3、AtNRAMP4 和OsNRAMP1(除OsRAMP2和AtRAMP2外)都参与铁的转运并对过量铁产生耐受性［10］。有趣的是，它们对镉耐受性影响刚好相反:在拟南芥中过表达AtNRAMP3对镉的敏感性反而增强［32］。此外，AtNRAMP3的过表达导致AtIRT1表达量下降，这表明两者可能竞争控制对铁的吸收［33］。水稻OsNRAMP1，位于内胚层和中柱鞘细胞的质膜上，它参与铁的吸收，当在拟南芥中表达时，增加根和茎叶对过量砷和镉的耐受性［34］。水稻的一个重要特点是富集高浓度的Mn，这是由位于质膜的根特异蛋白NRAMP5控制。除了对锰的影响外，它能促进镉和铁的富集［35］。

3 金属转运蛋白基因的转录调控

转录因子是提高植物重金属耐受性非常有效的方法。最近有报道表明，在受镉刺激后，拟南芥HMA3、MTP3、IRT2和铁调节基因2(IREG2)的转录由控制铁平衡的转录因子(FIT)AtbHLH38和AtbHLH39所控制。重要的是，这些转录因子的共同过表达使拟南芥对镉的耐受性增强，也诱导烟酰胺合成酶NAS1和NAS2的表达，这导致具有金属螯合作用的烟酰胺的合成［36］。其他控制金属转运蛋白表达的转录因子，包括与ZIP4相关的基本区域亮氨酸拉链(bZIP)转录因子bZIP19和bZIP23［37］。在缺铁时，合适的转录因子诱导促进铁的吸收(三价铁螯合物还原酶FRO2和IRT1)。只有在FIT存在的情况下，这些蛋白质才能表达［38］。同时还发现，FIT表达在圆叶南芥中比在拟南芥中弱［14］，这表明超富集的拟南芥与非超富集圆叶南芥在铁的吸收调控上可能不同。

4 金属硫蛋白(MTs)和植物螯合肽(PCs)

金属硫蛋白是广泛存在的低分子量、富含半胱氨酸和结合金属的蛋白质，它对金属解毒能力非常重要。它们清除活性氧种类(ROS)的能力与它们的作用方式有关［39］。当拟南芥金属硫蛋白基因AtMT2a和AtMT3在蚕豆中表达时，可以保护保卫细胞的叶绿体免受因镉的影响而引起的降解。这种影响是由于细胞中ROS含量变化所造成［40］。白菜金属硫蛋白BrMT1在拟南芥叶绿体中表达，能增强抗镉和氧化胁迫的能力［41］。陆地棉GhMT3a基因转入烟草中表达的试验表明:金属硫蛋白控制ROS含量的能力在对其他非生物胁迫的抗性上非常重要［42］。金属硫蛋白除了对ROS的调节，也控制重金属富集，如水稻OsMT1A过表达控制锌的富集［43］，拟南芥种子中特异性AtMT4A过表达控制铜和锌的富集。因此金属硫蛋白的过表达一般能提高植物重金属耐性。拟南芥植物过表达木豆CcMT1更加耐铜和镉［44］，而大蒜金属硫蛋白AsMT2b和芋CeMT2b既产生对镉的耐受性也促进其富集［45］。

植物络合素是由重金属诱导合成金属结合肽。它们通过巯基螯合重金属，由此产生的金属螯合物被隔离到液泡。然而，植物螯合肽合成酶(PCS)基因的过表达并不总是对重金属的抗性起有利影响。例如，在水稻中过表达小麦异源TaPCS1对镉的敏感性增加，显著增加茎叶镉的富集，但根除外［46］。另一方面，拟南芥突变体cad1-3和cad1-6因为缺乏植物螯合肽合成酶所以表现出明显的锌敏感并且根系中锌富集水平降低［47］。最近对水生植物金鱼藻植物PCS的研究表明，该蛋白在烟草［48］或拟南芥［49］中的表达都能提高植物螯合肽的合成并增强对镉和砷的富集。转PCS的NnPCS1基因莲植物，相比野生型提高了对镉的富集能力［50］。另一个发现是潜在的生物相关性:ATPCS与半胱氨酸脱巯基酶共表达能促进氧硫化物的生产和随后重金属在好氧条件下沉淀。这些蛋白共同表达的植物中比只过表达一种酶的植株对砷的富集量更大［51］。

5 细胞内氧化还原反应状态和提高植物重金属抗性

氧化胁迫与植物对重金属胁迫密切相关［4］。它是由一个范围广泛的生物和非生物胁迫诱导［52］和由ROS的增加引起的。一方面，ROS是重要信号分子，由于脂质过氧化产生过量的ROS可以对细胞膜造成不利影响，这可能导致细胞死亡。大麦暴露在镉中增加根中过氧化氢和超氧化物含量和降低了羟基自由基的产生。重要的是，ROS的分布也发生了显著的变化。这可能引发沿根轴的某些区域，发生特定的防御反应，如细胞壁交联和木质化［53］。此外，在低镉浓度下，只在表皮细胞产生超氧化物。较高浓度的镉增加根尖伸长区皮层组织超氧化物的数量，伴随着是诱导细胞死亡［54］。植物暴露于高浓度镉条件下产生过量的ROS导致脂质过氧化，随后就是细胞死亡［55］。有趣的是，在这种情况下，细胞死亡强度和沿根轴的分布依赖于离子［56］。这些结果表明，增强植物的抗氧化防御反应可能有利于重金属的耐受性。高羊茅中铜或锌超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶在氧化胁迫诱导启动子SWPA2作用下同时过表达，能提升其对镉、铜和砷的耐受性［57］。然而，氧化胁迫的发生，导致细胞有害降解产物的积累，如醛。乙醛脱氢酶基因AthALDH3的过表达，同样也提高对铜和镉的耐受性［58］。

6 展望

重金属的毒性是一个严重的环境问题。暴露于较高浓度重金属的敏感植物的生长和产量都显著降低，尤其是主要作物受到这种毒害将产生非常不利的影响。有害重金属会损伤植物的细胞结构和细胞膜，并抑制运输和基本代谢的进行。其中的一些负面影响也可能由其他非生物胁迫如干旱和盐分所造成的。但是，重金属胁迫也有一些自身独特的特征。重金属的植物耐受性反映了其阻止重金属的毒害的能力，耐重金属的植物通过阻止吸收重金属，在细胞外的络合作用，在细胞质中的络合和螯合作用，尽可能地将它们隔离在液泡中等方式来减轻重金属对其造成的伤害。要达到这些目标，植物必须能激活其防御反应，如激活抗氧化酶的表达、阻止或修复由于氧化胁迫所造成的二次损害。不同植物利用不同的策略来应对重金属毒性:从敏感到耐受和富集重金属。目前，主要用两种生物技术的方法来减少在自然界中重金属毒性的影响。一是在某些植物中增强吸收重金属的能力，这将增加它们对污染地区的植物修复效用。二是提高植物抗重金属毒害，这样可以防止植物的生长和产量受到抑制。以后应努力提高植物耐重金属的能力，从而减少有害重金属进入食物链的范围。

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