吴茱萸对黄连中小檗碱组织分布及肝脏摄取的影响

梁瑞峰，张 峰，刘方洲，丛德刚，代 震

(1.河南省中医药研究院中药研究所，河南 郑州450004;2.天津天士力制药集团股份有限公司，天津300410)

吴茱萸味辛、苦，性热，有小毒，归肝、脾、胃、肾经，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。《本草求真》曰其专入肝，历代医家多有用其引药入肝经。朱丹溪言:“头痛须用川芎，如不愈，各加引经药，太阳川芎，阳明白芷……厥阴吴茱萸。”《本草蒙筌》亦言本品“厥阴头疼，引经必用”。故大凡病在厥阴，多可用本品为引经药。出自《丹溪心法》的左金丸，由黄连、吴茱萸按6∶1 比例组成，此方虽用药简单，适应范围却甚广，不仅可以清肝胆之火，还能泻胃肠之热，有和胃降逆、制酸止呕等功效，为辛开苦降的代表方剂。方中重用黄连作为君药，清泻肝火，黄连亦善清泻胃热，胃火降则其气自和，一药而两清肝胃，标本兼顾。佐以辛热之吴茱萸，一者疏肝解郁，以使肝气条达，郁结得开;反佐以制黄连之寒，使泻火而无凉遏之弊;一者取其下气之用，以和胃降逆;可引领黄连入肝经，如此一味而功兼四用，以为佐使［1］。吴茱萸在左金丸中具有引经作用，本实验从大鼠体内分布的角度尝试探讨黄连吴茱萸配伍对黄连主要成分小檗碱在大鼠体内组织分布的影响。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康SD 大鼠，雌雄各半，体质量200 ～220 g，由河南省实验动物中心提供，许可证号:SCXK(豫)2010 -0002。

1.2 药品、试剂与仪器

黄连、吴茱萸购于河南张仲景大药房股份有限公司;盐酸小檗碱对照品，由中国食品药品检定研究院提供，批号110713 - 200911;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，国药集团化学试剂有限公司产品，批号F20100621;乙腈、甲醇均为色谱纯，天津四友精细化学品有限公司产品;磷酸二氢钠、乙酸乙酯，天津市化学试剂三厂产品。1100 型高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司产品;ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm )，大连依利特科学仪器有限公司产品;Biofuge Stratos 低温高速离心机，德国heraeus 公司产品;XW-80A 型漩涡混合器，上海精科实业有限公司产品;BS223S 型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。

1.3 检测指标

1.3.1 心、肝、肺、脾、肾组织中小檗碱的分布

分组与给药:将36 只SD 大鼠随机分为黄连组、黄连吴茱萸合用组两组，每组18 只。分别灌胃给予黄连粉末(1.8 g 生药/kg，粉末过100 目筛，用2 g/L 的CMC-Na 混悬)、黄连与吴茱萸混合粉末(2.1 g生药/kg，黄连∶吴茱萸为6∶1，粉末过100 目筛，用2 g/L 的CMC-Na 混悬)，每组大鼠每天给药1 次，连续给药5 d。分别于末次给药后1 h、2 h、4 h随机取6 只大鼠，以水合氯醛麻醉后取组织。样品处理与色谱条件:分别精密称取各组织样品0.5 g，加入甲醇与水混合液(1∶2)2 mL，制备组织匀浆。匀浆液以4 000 r/min 转速离心5 min，取上层液1.5 mL，加乙酸乙脂4 mL，涡旋3 min，以4 000 r/min转速离心5 min，分离有机层，用低于45 ℃的N2吹干，用100 μL 流动相溶解残留物，20 μL 进样。流动相为乙腈∶0.05 mol/L 磷酸二氢钠(30∶70 比例)，体积流量1. 0 mL/min，检测波长345 nm［2］，柱温25 ℃，进样量20 μL。

1.3.2 肝脏摄取率

将12 只大鼠随机分为黄连组、黄连吴茱萸合用组两组，每组6 只。用100 g/L 水合氯醛(3 μL/g)腹腔注射麻醉，腹部切口，结扎腹腔动脉与肝动脉，游离幽门静脉，用0.5 mm 的塑料管插入幽门静脉，尖端进入门静脉，用以静脉取样。游离上肠系膜动脉、右肾动脉和腹主动脉，在右肾动脉靠近右侧肾门处结扎，然后用动脉夹夹住右肾动脉入腹主动脉处，在动脉夹和结扎点之间作一切口，用0.5 mm 的塑料管插入右肾动脉，穿过腹主动脉进入上肠系膜动脉，插管固定后立即开通灌流，体积流量5 mL/min，同时通入氧气(体积分数95%的O2和体积分数5%的CO2，气体体积流量＜1 L/min)。快速打开胸腔，在右心房上做一切口，用1.5 mm 的塑料管插入切开的右心房，其尖端顺下腔静脉进入肝静脉，用作肝静脉取样。固定插管后将体积流量提高到7.5 mL/min。将上肠系膜动脉、右肾动脉和腹主动脉3 者分支处扎紧［3］。灌流液灌流平衡5 min 后，于十二指肠给药，分别给予黄连粉末(1. 8 g 生药/kg，粉末过100 目筛，用2 g/L 的CMC-Na 混悬)、黄连与吴茱萸混合粉末(2.1 g 生药/kg，黄连︰吴茱萸为6∶1，粉末过100 目筛，用2 g/L 的CMC-Na 混悬)，灌流液体积为1 000 mL。于给药后2，5，10，15，30，45，60，90，120 min分别从门静脉、肝静脉插管处取样，HPLC 检测，DAS 2.0 软件计算药-时曲线下面积(AUC)，计算肝脏摄取率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计分析软件处理。计量资料数据以均数(x-)± 标准差(s)表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠不同时刻心、肝、脾、肺、肾中小檗碱含量对比

给黄连后，小檗碱在大鼠体内的各脏器中，以肝脏中分布最高，其次为心脏、肾脏。黄连配伍吴茱萸后，小檗碱在肝脏中的分布依然最高，且比配伍前明显增加，差别有统计学意义(P ＜0.05)，说明两者配伍后吴茱萸使小檗碱的分布趋向于肝脏。见表1。

表1 各组大鼠不同时刻心、肝、脾、肺、肾中小檗碱含量对比 n=6，μg·g -1±s

表1 各组大鼠不同时刻心、肝、脾、肺、肾中小檗碱含量对比 n=6，μg·g -1±s

注:与黄连组对比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别心1 h 2 h 4 h肝1 h 2 h 4 h脾1 h 2 h 4 h黄连组 0.371±0.530 0.655±0.064 0.110±0.029 0.382±0.057 1.194±0.162 0.595±0.087 0.194±0.044 0.298±0.042 0.107±0.017黄连吴茱萸合用组 0.330±0.051 0.541±0.085 0.091±0.015 0.471±0.070* 1.843±0.218＊＊0.726±0.098 0.188±0.042 0.306±0.048 0.118±0.029组别肺1 h 2 h 4 h肾1 h 2 h 4 h黄连组 0.113±0.030 0.243±0.040 0.090±0.021 0.271±0.055 0.420±0.071 0.231±0.048黄连吴茱萸合用组 0.124±0.039 0.230±0.043 0.087±0.023 0.297±0.068 0.527±0.096 0.208±0.037

2.2 各组大鼠小檗碱肝脏摄取对比

大鼠肝脏灌流模型中，黄连组与黄连吴茱萸合用组门静脉处的AUC、肝静脉的AUC 对比，差别无统计学意义(P ＞0.05)，但两组小檗碱的肝脏摄取率对比，差别有统计学意义(P ＜ 0. 05)。结果表明:吴茱萸促进了黄连中小檗碱的肝脏摄取。见表2。

表2 各组大鼠小檗碱肝脏摄取对比 n=6±s

表2 各组大鼠小檗碱肝脏摄取对比 n=6±s

注:与黄连组对比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组 别 AUC门静脉/(μg·h -1·L -1) AUC肝静脉/(μg·h -1·L -1) 肝脏摄取率/%黄连组 102 538.80±13 463.85 63 529.33±11 623.48 38.2 0±6.39黄连吴茱萸合用组 101 525.70±14 322.40 53 336.83±9 809.51 47.60±5.02*

3 讨 论

吴茱萸主入肝经，既温肝降逆，又引药入肝，使肝之阴寒去，逆气平，而诸症除。左金丸中吴茱萸一味而功兼四用，以为佐使。

本实验结果显示:吴茱萸对黄连中的主要成分小檗碱在大鼠主要脏器的分布产生了明显的影响，明显提高了给药1 h、2 h 后小檗碱在大鼠肝脏的分布，促进了黄连中小檗碱的肝脏摄取，支持了吴茱萸“引药入肝”的作用。

药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程通常需要由转运蛋白介导完成。转运蛋白是位于细胞膜上的功能性膜蛋白，在肝脏有着广泛表达，其生理功能是将大多数内、外源性物质或药物等摄取进入肝脏，在肝脏经过一定的代谢转化，最终将其经胆汁排至肝外［4］。肝脏转运蛋白在药物肝胆转运中起重要作用，转运蛋白的活性与药物在肝脏的摄取、分布、代谢及排泄等密切相关。中药配伍引起的转运蛋白活性的改变可能是导致药效物质体内过程变化的重要机制［5］。吴茱萸是否通过影响肝细胞膜上的转运蛋白活性进而发挥引药入肝的引经作用，需要我们做进一步的研究。从转运蛋白的角度寻找中药配伍的普遍科学规律，除能验证经典方剂配伍的合理性外，更重要的是可利用这种规律指导中药的临床应用。

［1］邓中甲.方剂学［M］.第2 版.北京:中国中医药出版社，2010:108.

［2］刘春海，杨华生，李超.HPLC 法测定复方连芍片中盐酸小檗碱的含量［J］.中华中医药学刊，2007，25(9):1959-1960.

［3］尤杰，赫蕾，陈明苍，等. LC-MS 法测定离体大鼠肝灌流模型中知母皂苷B2 的含量及药动学研究［J］.中药新药与临床药理，2013，24(1):70 -74.

［4］张爱杰，刘克辛.肝脏转运体介导药物相互作用的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2012，20(28):2655-2660.

［5］闫广利，王喜军. 基于药物代谢酶和转运蛋白的中药方剂配伍规律研究［J］.世界科学技术——中医药现代化，2008，10(5):25 -29.