寿光市某犬瘟热病毒的分离鉴定及其致病性

李志松 （山东省寿光市畜牧兽医管理局 262700）

李志杰 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊） 王海燕 （山东省寿光市纪台镇畜牧兽医管理站）

犬瘟热是由犬瘟热病毒(canine distemper virus, CDV)引起的犬科动物的一种高度接触性和致死性传染病，发病率和死亡率都非常高[1,2,3,4]。临床上多以双相热、神经症状、结膜炎、鼻炎、支气管炎、肺炎、胃肠炎等为主要特征，严重影响养犬业的发展，并可能对多种毛皮动物以及珍稀动物熊猫、虎等的生命安全构成威胁[5,6,7]。CDV自1809年首次报道以来，目前已遍及全球，我国1980年首次分离到该病毒。近年来，犬瘟热在我国犬中的发病率和致死率有明显升高的趋势，其危害也日趋严重。开展犬瘟热流行病学的调查并对其致病性做系统研究为科学防制CDV具有重要意义。本研究从寿光市某病例中分离鉴定了一株CVD并对其致病性做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 细胞与病毒的分离鉴定 Vero细胞由山东畜牧兽医职业学院保存，其生长液为含10%胎牛血清的DMEM (pH7.2)，细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM(PH7.2)。病料来源于寿光市某动物门诊，经诊断试纸确诊为感染犬瘟热，采集死亡犬的肝脏、脾脏、淋巴结等器官组织一部分保存于-80℃备用，剩余组织剪碎研磨后与PBS缓冲液以1:10混合，反复冻融3次，于5000r/min在4℃下离心10min，取上清液，再放入离心机以12000r/min在4℃下离心20min。取上清液以0.22ul滤器过滤后接种于Vero细胞培养，37℃2h后换为维持液，同时设有空白细胞对照组。将出现病变的细胞培养液、CDV阳性血清和无血清培养物进行双向琼脂扩散，同时设置对照组，将出现稳定病变的病毒以终点稀释法将病毒液(第4代)按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释接种于24孔板，每个梯度重复3孔，收集病变的细胞孔培养液，冻融3次后再接种细胞作扩大培养。

1.2 分离病毒的理化特性测定 将初步培养纯化的病毒接种Vero细胞后9d收获病毒，冻融3次后在4℃下12000r/min离心15min，取上清液保存于-80℃冰箱中。将病毒液的pH调至9.0后在37℃下作用2h，再用0.5%HCI调节pH至7.2左右，每孔加入100µl的DEME(2%FBS，pH7.4)作10倍梯度稀释，每个稀释度重复3孔，于37℃下培养并观察细胞病变以判断病毒的耐碱性。将病毒液用0.5%HCI调pH至4.5，37℃作用2h后，再用1.4% NaHCO3调pH到7.2左右，其余操作同上，确定病毒的耐酸特性。将病毒液稀释至10-6，56℃下作用30min后，接种新长满单层细胞的96孔板，每个梯度12孔，并在37℃下培养观察，同时设有对照组。

1.3 分离病毒的血凝性测定 将病毒液做倍比稀释至1:640后分别吸取25µl滴加于96孔V型板中，依次加入25µl生理盐水和50µl 1%鸡红细胞混匀，于4℃和37℃下作用1-2h后观察血凝性，并设对照孔。按同样的方法，观察病毒对绵羊和兔子红细胞的血凝性。结果判定标准：++++：为100%凝集，红细胞均匀铺于孔底，呈伞状或荷叶状卷边。+++：为75%凝集，与上基本相同，但边缘有少量红细胞小凝块。++：为50%凝集，红细胞呈圆盘状沉于孔底，周围有明显小凝块。+：为25%凝集，红细胞沉于孔底，周围有少量小凝块。-：为不凝集，红细胞沉于孔底，呈圆点状。

1.4 分离病毒的TCID50测定 在经胰酶消化后长满的单层Vero细胞中加入含10%FBS的DMEM充分吹打均匀，放置于37℃培养，取100µl经10倍梯度稀释的病毒液进加入上述长成的单层细胞中，并设定对照，在37℃吸附1h后补足营养液并培养。逐日观察记录病变至10d后，按照Reed-Muech法计算分离病毒的TCID50。按照同样的方法计算接毒细胞在2d、4d、7d、9d和12d的TCID50。

1.5 分离病毒的致病性试验 选1月龄未免疫经诊断为阴性的健康幼犬8只，分为4组，每组2只，隔离饲养。第1-3组为试验组，分别注射滴度为1×105.0TCID50、3×105.0TCID50、6×105.0TCID50病毒液1ml，第4组为空白对照组。接毒后每日测体温2次并观察临床症状，出现症状并死亡后立即采集肺脏、肝脏和脾脏，浸泡于10%的甲醛中，用于病理切片，同时取膀胱粘膜上皮细胞，自然干燥后用甲醇固定3min，苏木精染色20min，0.1%伊红染5min，干燥后检查包涵体，同时检测发病犬的眼睛和鼻中浆性分泌物。

2 结果

2.1 病毒的分离培养 将病毒液接种于Vero细胞上，在37℃培养下约第5d开始出现CPE，细胞逐渐圆缩、折光性增强，第6-7d的CPE范围扩大，呈现空泡化，第8d开始出现细胞拉网脱落，第9-11d细胞出现大面积拉网脱落。琼脂扩散试验表明，分离毒株与CDV阳性血清呈清晰的沉淀带，为强阳性，将该毒株定名为CDV-sg株。

2.2 分离病毒的理化特性 CDV-sg株在pH7.0～8.0下病毒活性不受影响，而pH6.0以下和pH9.0以上病毒活力受到一定影响，说明CDV-sg较耐酸碱，但是过酸过碱均不利于病毒的生长。该试验接种CDV-sg株病毒液在56℃下作用30min的细胞均未出现CPE，而未处理的细胞观察10d发现各稀释度的细胞均出现不同程度的CPE，可知CDV-sg株对温度敏感，30min就可将其灭活。

附表 不同pH值病毒的活力

2.4 分离病毒的血凝试验 鸡、兔、绵羊红细胞与各稀释度的CDV-sg病毒液与在37℃分别作用1-2h，红细胞均沉于孔底，呈圆点状，表明CDV-sg对鸡、兔、绵羊红细胞等均具备有血凝性。

2.5 分离毒株的致病性试验 接种6×105.0TCID50的2只犬临床症状明显，第4～7d出现体温呈双相热、-食欲废绝、眼角有脓性分泌物，最终衰竭死亡，其中一只病死犬呈角弓反张势；接种3×105.0TCID50的两只犬均出现精神沉郁、厌食，于接种后7d出现轻微的体温升高，但未死亡；接种1×105.0TCID50的两只犬临床症状不明显，而未接种的犬均正常。对发病犬只的眼和鼻的脓性分泌物检测为CEV阳性。将死亡的犬进行剖检，发现肺尖出血、肝肿和淋巴结肿大、腹腔积液、肠系膜充血脱落。病理切片显示肺泡结构消失，有大量的炎性细胞，肺泡壁增厚，上皮细胞中出现包涵体；脾小体坏死，脾小梁平滑肌变性，内皮细胞出现包涵体。

3 讨论

CDV虽然具有脂囊膜，但易被光和热灭活，对环境的抵抗力也较弱，病毒的分离成功率很低，所以病料采集的部位、时间、样品的处理方式、发病动物的病程类型和抗体水平等因素都会影响病毒的分离。据报道分离培养CDV的传代细胞系包括非洲绿猴肾细胞系(Vero)、猫胚胎细胞系(FE)、犬肾细胞系(MDCK)、猫肾细胞系(CRFK)等细胞，但传代细胞具有传代不稳定的缺点，易发生毒力降低或细胞病变等现象。目前研究中培养CDV最常用的传代细胞是Vero细胞，Vero细胞在接种后逐日可观察到细胞变圆，胞质内颗粒增多，胞浆空泡化，部分细胞坏死、脱落，呈拉网状等现象。病毒纯化一直是病毒研究中的难点，病毒纯化方法归结起来主要有物理和化学的方法，而不损害病毒粒子活性才是纯化的关键。

CDV病毒的抵抗力不强，对热和干燥敏感，50～60℃经30min可灭活，炎热季节CDV在犬群中不能长期存活，但在-10℃可存活几个月，在-70℃或冻干条件下能长期存活，这是CD多流行于冬春季节的最主要原因。CDV属于RNA病毒，对热和干燥敏感，对环境的抵抗力弱，0℃以上感染力减弱，10℃感染力能迅速丧失，且极易被32℃以上的高温和可见光灭活。CDV的分离比较困难，采样的时间、部位、样品处理、病程的类型等因素对病毒的分离都有一定的影响。为了防止脏器中RNA酶对CDV的降解，本试验在患病犬死后立即采取新鲜脏器，并马上接种于vero细胞中进行分离培养。虽有报道犬肺巨噬细胞(DLM)对CDV的初次分离非常有效，但DLM的分离和培养较难，容易受到污染，不利于试验的进行，而Vero细胞对大多数动物病毒具有广嗜性，CDV能在该细胞上进行复制，因此本试验采用Vero细胞对CDV进行分离培养。

本试验中接种6×105TCID50的试验犬于接种后4-6d出现体温升高，在第一次发热后6～8d再次出现体温升高，与田克恭、遇秀玲报道的一致。而本次试验通过犬出现食欲废绝、鼻卡他、体温呈双相热、腹泻，眼、鼻出现脓性分泌物，剖检见病犬肺尖出血、肝脏肿大、淋巴结肿大、腹腔有积液、肠系膜充血脱落、脾脏边缘出血梗死等病变，病理切片还观察到了肺脏、肝脏和脾脏的明显病变均显示了典型的临床症状。

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