寿光鸡中禽网状内皮组织增生病毒的分离鉴定及其env基因序列分析

王海燕 （山东省寿光市纪台镇畜牧兽医管理站 262722）

李志松 （山东省寿光市畜牧兽医管理局） 李志杰 （山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊）

禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是禽类的一种重要的致肿瘤性疾病，其病原禽网状内皮组织增生病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)是一个禽反转录病毒群，与禽白血病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)、马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)一样是引发禽类发生肿瘤的常见病毒。REV不仅可以感染鸡，还可以感染火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和野鸡等[1]。

REV主要诱发鸡急性网状细胞肿瘤、淋巴组织和其它组织的慢性肿瘤等。除肿瘤外REV还可导致感染禽类胸腺、法氏囊等免疫器官萎缩、免疫抑制、生产性能下降等。禽通常可经垂直传播、水平传播感染REV，但是通常使用了被REV污染的活疫苗也可以造成REV的感染，但这种情况很少出现肿瘤，仅呈现抗体阳性。近年来，我国不同鸡群中REV的流行率有增高趋势，特别是在地方品系鸡中血清抗体阳性率增高极为明显[2,3]，显示在我国的一些地方品系鸡中存在REV感染的巨大风险。本研究从山东省地方品系寿光鸡中分离鉴定了3株REV并对其env基因进行了测序分析。

1 材料与方法

1.1 病料来源与背景 2013年10月山东潍坊寿光某鸡场饲养的商品代寿光鸡发生肿瘤病例，剖检可见肝脏和脾脏有肿瘤，随机抽取100只鸡翅静脉采血，分离血清后分别用Avian Leukosis Virus Antibody Test Kit(ALV-A/B), Avian Leukosis Virus Antibody Test Kit-Subgroup J (ALV-J), Reticuloendotheliosis Virus Antibody Test Kit(IDEXX Laboratory, USA)按照说明书检测REV和ALV血清抗体，有39份血清样品显示REV抗体阳性。怀疑本鸡群存在REV感染。

1.2 病毒的分离鉴定 从鸡群中随机抽取10只鸡，每只鸡均无菌静脉采集抗凝血1ml，1500r/min，离心2min后取血浆接种于已长成单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)，在细胞培养皿中提前放入灭菌的细胞爬片。接种后细胞在37℃孵育1h后弃掉培养液，更换为含1%新生牛血清(GIBCO，USA)的DMEM维持液，继续在37℃培养8d。盲传1代维持7d后收集培养上清液冻存于-80℃备用，培养有细胞的盖玻片以丙酮与乙醇冰(3:2)混合液固定5min。然后分别以针对ALV-J的单克隆抗体、马立克氏病病毒(Marek’s disease virus, MDV)单克隆抗体、REV单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测。最后加一滴50%甘油于盖玻片上，在荧光显微镜下观察实验结果[4]。

1.3 分离毒株env基因的扩增、克隆和测序 CEF在接种REV维持6d后收获细胞，经洗涤、离心沉淀再用抽提缓冲液(100mmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl pH 8.0, 25mmol/L EDTA pH 8.0, 0.5%SDS)悬浮后，加入蛋白酶K(100ug/ml)消化过夜，再用苯酚抽提和乙醇沉淀后，溶解于TE(10mmol/L Tris-Cl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)中即为样品模板DNA(50～100ng/μl)。参照已发表的文献合成了一对引物用于扩增分离毒株的env基因[5]。反应体系参照文献配置，扩增条件为：95℃预变性5min；95℃，60s.55℃，50s,72℃，2min；33个循环；72℃,10min。以正常CEF基 因组DNA作为阴性对照。将PCR扩增产物经1.0%琼脂糖电泳鉴定并将目的条带切下以E.Z.N.A Gel Extraction Kit (OMEGA, USA)回收纯化DNA，将纯化DNA连接PMD-18T Vector(TaKaRa，大连)后转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，随机挑取菌落以Plasmid Mini Kit(OMEGA，USA)提取质粒进行酶切鉴定，选取鉴定为阳性克隆子送上海生工生物工程有限公司测序，序列以DNAStar软件进行分析。为了分析所分离毒株的分子演化趋势，选取了来源于鸡、鸭、鹅等不同物种的REV参考毒株的env基因进行同源性比较和进化分析，参考毒株及GenBank登录号见表1。

表1 用于env氨基酸序列比较所用REV参考株及其GenBank登录号

2 结果

2.1 REV的分离鉴定 IFA检测结果表明有3份样品显示REV阳性，与未感染的样品相比，阳性样品的胞质内均有明显的特异性绿色荧光，细胞核未被染色呈现灰暗色(图1)；而MDV和ALV均为阴性。分离到的REV命名为SD1301、SD1302和SD1303。

2.2 REV分离株env基因的克隆测序与序列分析 以SD1301、SD1302和SD1303感染后细胞总DNA为模板，用PCR均扩增出了约2kb左右的清晰条带，与预期目的片段相符；阴性对照未扩增出相应的条带。对3个阳性样品的PCR产物测序结果表明，SD1301、SD1302和SD1303三个毒株的env基因全长均为1761bp，编码587个氨基酸，3株REV之间env基因的核酸同源性为100%；与7株不同参考株序列比较显示与近年来分离自中国黑龙江的HLJR0901亲缘关系最近(图2、图3)，处于进化树上同一分支。

图1 IFA检测感染细胞中的REV感染

3 讨论

REV既可水平传播又可以垂直传播，但以垂直传播为主。由于REV的宿主范围和传播途径特点使得REV迅速传播到世界各地，严重威胁着养鸡业的发展。此外，在禽用弱毒疫苗如鸡痘病毒疫苗中污染REV引起的REV爆发案例也时有报道并会引起诸多纠纷[6]。近年来，我国鸡群中REV的血清抗体阳性率逐渐增高，特别是在地方品系鸡中尤为严重[2,3]，并且REV与其它鸡免疫抑制性病毒的混合感染也比较普遍[7-9]。本研究即从山东省地方品系鸡中分离到定了3株REV，显示地方品系鸡中REV的感染仍然是不容忽视的问题之一。

图2 分离REV与参考毒株env氨基酸同源性

图3 以env基因WFSG1301和WFSG1302与不同REV 参考毒株的进化关系

在REV的各基因中，编码囊膜蛋白的env基因相对变异较快。通常人们通过对不同毒株env基因的序列分析来显示REV的分子进化。然而对本研究分离的3株REV进行env基因序列的测定和分析显示，3株REV之间的env基因之间竟然同源性为100%，并且他们与Chicken/3337/05(分离自中国台湾)、APC-566(分离自美国)、FA(分离自美国)、Goose/3410/06(分离自中国台湾)、HLJR0901(分离自中国黑龙江)等多个参考毒株也有高达99.9%的同源性，综合考虑这些参考毒株的分离地区及其年份，推测上述3株REV分离株与分离自东北地区的HLJR0901等毒株可能有共同的来源，当然不排除另一种可能，那就是都使用了同样污染有REV的疫苗。

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