石斑鱼及暂养环境中副溶血弧菌分离鉴定与毒力评价*

高 磊 邓益琴 刘助红 龙云映 陈 偿

(中国科学院南海海洋研究所 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室 广东省应用海洋生物学重点实验室 广州 510301)

副溶血弧菌最早是由Fujino等(1953)于1953年从日本一个食物中毒患者体内初次分离得到的, 是一种革兰阴性嗜盐菌, 属弧菌科弧菌属成员。副溶血弧菌广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中, 是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌, 可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应, 严重者可引起败血症。我国沿海地区每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的报道。

大量研究表明, 副溶血弧菌的致病作用与其产生的多种溶血素有关, 主要是耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin, TDH)、TDH相关溶血素(TDH-related hemolysin, TRH)和不耐热溶血素(thermolabile hemolysin, TLH) (宁喜斌等, 2008)。神奈川现象(Kanagawa phenomenon, KP)一直被认为与副溶血弧菌主要毒力因子之一TDH引起的β溶血现象有关。此外, TRH和TLH也能引起相关的溶血, 而KP也成为检测副溶血弧菌致病性的一个重要生化指标。III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)广泛存在于革兰阴性病原菌中, 负责分泌与细菌毒力相关的多种蛋白质, 大量报道表明其与许多病原菌密切相关, 不同病原菌根据自身的需要, 通过T3SS的不同毒力策略导致临床表型。已发现副溶血弧菌存在两个T3SS基因簇, T3SS-1介导副溶血弧菌的细胞毒性作用, 其VopQ, VopS和VPA0450等效应蛋白涉及诱导自噬性死亡(Burdetteet al, 2008;Broberget al, 2010)。而T3SS-2与副溶血弧菌的肠毒性有关(Makinoet al, 2003; Parket al, 2004; Onoet al,2006; Burdetteet al, 2009), 主要在临床上的分离株中被发现, 并与副溶血弧菌流行株和疾病大暴发相关(Parket al, 2004), 且没有T3SS-2的菌株普遍被认为缺乏潜在的致病性(Caburlottoet al, 2010), 其效应蛋白VopC, VopT, VopA和VopL与各种引起肠毒性的细胞过程相关(Broberget al, 2011)。

细胞死亡不仅是生命有机体在生长发育过程中的正常生理现象, 同时也在抵抗外界病原细菌侵染的过程中发挥至关重要的意义。因此, 可利用感染细胞实验来评价副溶血弧菌的毒力(Grassméet al,2001)。此外, 体内毒性实验是最直观、最具说服力的细菌致病力指标。很多动物模型已被用于研究副溶血弧菌的致病机理, 包括小鼠口胃和腹腔注射, 兔回肠循环模型以及哺乳期兔和小鼠的口头感染。其中的一些试验表明, 副溶血弧菌通过口灌或腹腔注射可以引起小鼠死亡。这些模型为副溶血弧菌的病理生理学提供了线索(Piñeyroet al, 2010)。

作为食源性致病菌, 人们认为海鲜产品极易被副溶血弧菌污染, 但是迄今为止, 还没有直接证据证明海鲜产品生产、运输和暂养环境中副溶血弧菌能致病。多个研究结果显示这些环境中的副溶血弧菌与临床菌株间表型及致病性等方面存在极显著差异(Theethakaewet al, 2013), 因此对这些环境中的副溶血弧菌致病力进行研究, 将有助于了解环境菌株与临床菌株的关系, 并确定海鲜产品在生产和流动过程中副溶血弧菌污染的风险, 本研究将以石斑鱼暂养环境为例进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞及KM(昆明)鼠 副溶血弧菌从广州黄沙水产市场石斑鱼及其养殖水体、广州明记海鲜酒楼海鲜石斑鱼及其养殖水体中分离得到; 胖头鱼肌肉细胞(FHM细胞)由本实验室保存; KM鼠由广州中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 培养基 TSA、TSB、TCBS培养基购自美国BD公司, 2216E培养基、我妻氏血琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司, Medium199培养基购自杭州吉诺生物医疗技术有限公司。

1.1.3 主要试剂 无菌脱纤维兔血购自广州蕊特生物科技有限公司, 细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司, PCR及电泳相关试剂购自大连Takara公司, 4%多聚甲醛固定液购自广州晶欣生物科技公司, 胰酶(Trypsin)、血清购自美国Gibco公司。

1.2 引物设计与合成

副溶血弧菌鉴定基因gyrB扩增引物序列, 参考Venkateswaran等(1998); 副溶血弧菌毒力基因检测引物序列, 其中tdh、trh、tlh基因引物序列参考Bej等(1999), T3SS效应蛋白的引物序列, 通过NCBI下载基因序列, 并通过引物设计软件Premier 5设计相应引物。引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成(表1)。

1.3 菌株分离、纯化、保种及初步鉴定实验

在黄沙水产市场及明记海鲜酒楼等石斑鱼暂养环境中设立监测点, 每1—2周取样一次, 连续监测,采集样品为石斑鱼及其暂养水体。对于石斑鱼, 进行常规解剖, 用接种环刮取体表、鳃、心、肝、脾、肾等处的黏液后于3%盐度的TSA平板中划线分离纯化;对于水体样品, 将水样摇匀, 取100uL涂布于3%盐度的TSA平板中分离并多次纯化, 挑克隆后用甘油终浓度为20%的2216E培养基于-80°C冻存; 通过弧菌选择性培养基TCBS对分离菌株进行初步鉴定。

1.4 菌株PCR鉴定实验

用Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA; 50uL PCR反应体系含10×PCR 缓冲液5uL, dNTP 混合液 (10mmol/L) 4uL, gyrB 上游引物(10μmol/L) 2uL, gyrB 下游引物 (10μmol/L) 2uL, Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5uL, DNA模板1uL, 加水至50uL; 扩增产物取5µL用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,并由上海英俊生物技术有限公司测序, 对测序结果进行NCBI在线Blast比对分析及多重序列比对分析;引物序列、扩增程序、目的片段大小及参考文献参照表1。

1.5 已鉴定副溶血弧菌毒力基因的PCR检测实验

基因组提取、PCR体系、琼脂糖检测及测序参照菌株PCR鉴定实验, 引物序列、扩增程序、目的片段大小及参考文献参照表1, 对测序结果进行NCBI在线Blast比对分析。

1.6 神奈川溶血实验

将副溶血弧菌接种于1% NaCl的TSB (pH=7.6—8.0)培养基中, 30°C、230r/min摇床培养约15h后取1uL点种到我妻氏血琼脂平板, 37°C恒温培养箱中培养24h, 观察溶血结果(Wagatsuma, 1968; Takeda,1983), 重复实验三次。

表1 本研究中所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.7 细菌感染实验

将接种于2216E培养基中, 30°C、230r/min摇床培养约15h后的待测菌株, 3000r/min, 离心3min后,用新鲜培养基重悬菌沉淀, 并稀释至OD600(吸光度)=0.4, 然后用10uL稀释后菌液感染FHM细胞, 使感染复数达到100。2h后用4%多聚甲醛固定0.5h, 然后用Hoechst33258染色, 于倒置荧光显微镜下观察细胞形态尤其是细胞核的变化, 确定细胞死亡情况并拍照, 重复实验三次。

1.8 KM鼠灌胃实验

将接种于2216E培养基中, 30°C、230r/min摇床培养约15h后的待测菌株, 测定其OD600后, 进行梯度稀释, 用10–5、10–6稀释度的菌液100uL涂布于含3%盐度的TSA培养基平板中, 每个浓度涂布3个平板, 30°C恒温箱中培养约15h后, 对每个平板上的菌落进行计数, 选择一个合适的稀释度(一般每个平板上的菌落数为30—300个为有效计数)进行菌落的平均计数, 用以确定1mL菌液中1个OD600的细菌数量。

将待测菌株接种于2216E培养基中, 30°C、230r/min摇床培养一定时间后, 4000r/min离心3min后, 去上清, 用2216E培养基悬浮细菌, 使得最终菌液浓度为(1.5—2.5)×109CFU/mL, 并对10—12g的KM鼠进行灌胃。每只小鼠灌胃菌液0.2mL, 即(3.0—5.0)×108CFU, 每种待测菌株灌胃5只KM鼠,并设置一组灌胃2216E培养基作为对照, 观察灌胃后一周内KM鼠的死亡情况, 以确定各待测菌株对KM鼠的致病致死情况。

2 结果

2.1 菌株筛选结果及其形态特征

2011年10月到2012年3月, 共分离纯化得到菌株281株, 根据菌落来源、表型等选取各环境中分离到的有典型意义的菌株共12株。这些菌株通过弧菌选择性培养基TCBS初步鉴定, 结果MJ01-1、MJ03-1、HS51-5、HS52-3、HS54-4 共5株在TCBS平板上呈绿色, 可能为副溶血弧菌。

2.2 PCR鉴定结果

初步鉴定为副溶血弧菌的菌株中, 在菌体基因组质量检测合格的条件下, 均有gyrB鉴定基因目标条带(图1); 测序Blast比对后, HS52-3为创伤弧菌,其余4株为副溶血弧菌(图2), 且多序列比对分析结果显示, HS52-3与其余4株相似性很低, 其余4株之间相似性很高, 因此, 这4株副溶血弧菌作为毒力评价的待测菌株。

图1 待测菌株gyrB基因的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of gyrB gene

2.3 副溶血弧菌毒力基因检测结果

鉴定得到的4株副溶血弧菌均有tdh基因和tlh基因, 而均没有trh基因; 均含有所检测的T3SS-1效应蛋白基因vopQ、vopR、vopS和vpa0450; 只有HS51-5和HS54-4含有所检测的T3SS-2效应蛋白基因vopC、vopT、vopA和vopL, 而MJ01-1和MJ03-1都只含有vopA(图3, 表2)。

表2 副溶血弧菌的毒力基因分布Tab.2 Virulence genes of V. parahaemolyticus

2.4 副溶血弧菌神奈川溶血检测结果

4株副溶血弧菌在我妻氏血琼脂上均有KP现象的典型特征, 菌落周围都有一明显的透明溶血圈, 其中MJ01-1的溶血圈较其它3株大、而且亮, 显示为较强溶血。

2.5 细菌感染实验结果

FHM细胞, 经待测副溶血弧菌感染之后, 细胞均有死亡, 而阴性对照菌没有细胞死亡, 说明待测副溶血弧菌都存在细胞毒性。通过Hoechest33258染色后, 在荧光显微镜下观察到HS51-5、HS54-4、MJ01-1、MJ03-1导致细胞死亡的表现均为: 细胞大量死亡, 细胞变圆脱落、细胞核皱缩、DNA片段化并形成凋亡小体。但是HS51-5、MJ01-1导致细胞死亡的情况较HS54-4、MJ03-1严重, 这表现为感染时间均为2h, 但HS51-5、MJ01-1导致细胞死亡后, 细胞核严重皱缩, DNA严重片段化(图4)。

2.6 副溶血弧菌对KM鼠的体内毒性结果

通过对KM鼠进行灌胃待测副溶血弧菌, 每组灌胃5只KM鼠, 并通过设置灌胃2216E培养基为阴性对照。在灌胃后的24h内, HS51-5只导致本组4号死亡, 之后也没有小鼠死亡, 死亡率为20.00%; HS54-4导致3只KM鼠死亡, 并在接下来的24h内又导致1号KM鼠死亡, 最后只有4号存活, 死亡率为80.00%;MJ01-1导致4只KM鼠死亡, 只有2号存活, 之后2号也没有死亡, 死亡率为80.00%; MJ03-1导致5只KM鼠均死亡, 死亡率达到100.00%。在48h后, 存活的小鼠没有死亡, 活动也正常(表3)。

3 讨论

目前为止, 对副溶血弧菌致病性的研究已有很多。本研究旨通过毒力基因分布、神奈川溶血、细胞和动物模型的毒性分析, 评价石斑鱼暂养环境中副溶血弧菌对人的致病风险。

副溶血弧菌作为一种食源性致病菌, 主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中。由于生吃或食用未熟的海产品可导致患者腹泻、恶心、发烧等典型的胃肠炎及食物中毒, 本病多在夏秋季发生于沿海地区, 常造成集体发病(宁喜斌等, 2008)。在本研究中, 对运输(广州黄沙水产市场)和销售(广州明记海鲜酒楼)等海鲜暂养环境进行采样、分离、纯化菌株,最后在运输环节中, 选取的10株菌株中有2株是副溶血弧菌, 并且其中有一株在KM鼠体内毒性实验中毒性不强; 而销售环节中选取的2株细菌均为副溶血弧菌, 且2株毒性都较强。

图2 待测菌株gyrB 基因的多重序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of gyrB gene in the strains

表3 副溶血弧菌导致KM鼠的死亡情况Tab.3 Death of the Kunming mice induced by V. parahaemolyticus

此外, 鉴定得到的4株副溶血弧菌均有tdh和tlh基因, 而均没有trh基因。一般认为tdh与神奈川溶血相关(Broberget al, 2011), 而trh的存在可能抑制tdh的表达(宁喜斌等, 2008),tlh的作用目前尚不清楚。本研究的KP实验结果也验证了这一点, 即4株待测副溶血弧菌都存在神奈川溶血现象。

一般而言, T3SS-1与细胞毒性有关。本研究中, 4株待测副溶血弧菌均含有所检测的T3SS-1效应蛋白基因, 而通过细菌感染实验, 我们可以看到这4株待测菌株都对FHM细胞存在细胞毒性, 都使得细胞变圆、细胞核皱缩以及DNA片段化, 但具体是凋亡、自噬性细胞死亡、胀亡或促炎症细胞死亡中的哪种死亡方式(Finket al, 2005), 我们尚无定论, 这还需要通过TUNEL标记、Caspase活性检测、自噬泡形成检测和LDH释放等不同方法来分析T3SS-1导致FHM细胞死亡的特征, 从而揭示细胞死亡的具体方式, 但是本研究中检测的T3SS-1的vopQ、vopR、vopS和vpa0450效应蛋白基因, 除vopR的作用机制尚不确定之外, 其余三种效应蛋白基因均涉及诱导细胞自噬性死亡(Burdetteet al, 2008; Broberget al, 2010), 因此, 我们推测这4株待测菌株通过诱导自噬途径导致细胞死亡。

另外, 对于T3SS-2, 一般认为其与肠毒性有关。本研究中检测了vopC、vopT、vopA和vopL四种效应蛋白基因。HS51-5和HS54-4都含有这四种基因, 而MJ01-1和MJ03-1都只含有vopA。在KM鼠体内毒性实验中, 4株待测菌株都具有毒性, 但是HS51-5的毒性较弱。这与基因检测结果不太一致, 但是从本研究中所检测基因的作用来看,vopC和vopT还是主要与细胞毒性有关(Broberget al, 2011), 而vopA和vopL与细胞转录有关(Broberget al, 2011), 而且T3SS-2的效应蛋白不止于这四种, 因此, 还需要通过检测更多可能的效应蛋白基因, 并进行基因敲除与回补等方法进一步确定与待测菌株致病致死有关的效应蛋白。

图3 副溶血弧菌毒力基因的PCR检测Fig.3 PCR identification of virulence genes in V. parahaemolyticus

图4 副溶血弧菌诱导FHM细胞的细胞核皱缩和片段化Fig.4 Shrinkage and fragmentation of FHM (fat head minnow) cell nucleus induced by V. parahaemolyticus

通过本研究的各项实验, 可以看出副溶血弧菌的致病机制非常复杂, 而且一些毒力因子的作用机理以及它们之间的相互作用并不是十分的清楚, 还需要更进一步研究。但不同的检测手段从不同水平对副溶血弧菌进行致病性检测, 它们之间的确存在着相互联系。

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