饲料亮氨酸水平对青虾主要非特异性免疫指标的影响

付天增 赵丽娟 李 娴 曹振杰* 王雪鹏

（①山东省淡水渔业研究院 山东 济南 250013 ②山东农业大学动物科技学院 山东 泰安）

蛋白质是一切生命的物质基础，同时蛋白质也是水产动物饲料中价值最高的成分。 蛋白质由20种氨基酸组成，其中10种非必需氨基酸，8种必需氨基酸。亮氨酸(Leucine)被证明是青虾的必需氨基酸之一，此外，亮氨酸和撷氨酸以及异亮氨酸被称为支链氨基酸(BCAAs)。亮氨酸是支链氨基酸中唯一的生酮氨基酸，可以刺激胰岛细胞释放胰岛素，和撷氨酸和异亮氨酸一起可以起到保护肌肉的作用，同时也可以抑制蛋白降解和促进机体蛋白合成，主要表现在骨骼肌上；对血红蛋白合成和维持血糖水平以及激素的增加有重要作用，同时是肌肉应激和能量代谢上起重要作用；氨酸的缺乏可导致各组织和器官功能降低。

目前关于青虾的蛋白取值范围[1-2]已有所研究，鱼类和凡纳滨对虾亮氨酸需要量及日本沼虾赖氨酸的研究也有部分报道[3]，但对青虾亮氨酸非特异性免疫的影响报道极少。本实验的研究目的是饲料中不同亮氨酸含量对一些主要非特异性免疫指标丙氨酸转氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)等的影响。

1 材料和方法

1.1 试验设计和饲料的制备 饲料配方及其营养组成见表1。饲料以中粮虾饲料为基础饲料，添加L-晶体氨基酸以满足虾除亮氨酸外其它必需氨基酸的需要。饲料中亮氨酸的添加水平分别为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，实测各组饲料亮氨酸含量分别为：1.91%、2.13%、2.32%、2.50%、2.74%。

准确称量饲料，然后添加亮氨酸，采取逐级扩大法混合均匀，用双螺杆挤压机制成粒径为1mm以及1.5mm的颗粒饲料。晾干至含水分约10%，之后分别放入封口袋中存放入-20℃冷冻保存备用。

1.2 试验管理 饲养试验在山东农业大学养殖基地营养车间进行，所用青虾虾购自山东微山湖。试验虾选用同一批进口一代虾苗。试验前，试验虾苗暂养于桶中，并以虾片和商业饲料饱食投喂。选择1.0g左右的青虾进行分组试验。

表1 饲料配方组成及营养成分分析(干物质) (%)

每个试验组分三个重复，每个重复30尾虾，放养于0.7×0.9×1.0的网箱中，养殖试验持续8周，投喂4次/d，投喂时间分别为7:00、12:00、17:00以及21:00，按照体重的8%～10%进行投喂，早晚投喂量为总投喂量的60%，投喂1h后观察其摄食情况，以调整其投饵量。前期每两天换一次水，中后期每天换水。试验过程中不间断充气，试验 水 温 为26～31℃、水 质pH 为7.5-7.6、DO 为6.12～ 6.45mg/L；氨氮为0.14～0.25mg/L。

1.3 样品采集和分析方法 试验结束时停食24h，称重并记录尾数。每组随机取5～7尾虾，保存于-20℃冰箱备用，另取10尾虾，于围心腔取血，置于1.5ml离心管中于4℃冰箱静置过夜，3000 r/min离心15min，取上清液分装于-80℃冰箱备用，并测定血淋巴中天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)和丙氨酸转氨酶(ALT)。取血后的虾剥离肌肉，放于液氮罐中，保存于-80℃冰箱，以分析肌肉的常规营养组成。（1）饲料常规分析：试验样品的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量按照标准方法(AOAC,1984)测定。采用105℃下烘干至恒重并测定水分含量;采用凯氏定氮法测定粗蛋白质含量；采用索氏提取法(以石油醚为提取液)测定粗脂肪含量;粗灰分含量采用550℃马弗炉灼烧法。（2）酶活力的测定[4]：均采用南京建成生物技术有限公司试剂，用酶标仪测定。选择饲料3用于测定饲料的溶失率，称取5g试验料置于盛有1000m1水的烧杯中，测其浸泡30、60和90min后的氨基酸组成。溶失率测定参照Lucia Elizabeth等的研究方法。

1.4 数据统计分析 所有数据采用“SPSS version 17.0"软件对数据进行统计分析，试验结果以平均数士标准差表示，对数据作单因素方差分析(ANOVA)，结果作Duncan's进行多重比较，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 饲料中不同浸泡时间对亮氨酸溶失率的变化 饲料中亮氨酸的溶失率见表2。再对亮氨酸含量为2.32%的试验饲料3分析中，得知亮氨酸在30、60、90min的溶失率分别为10.92%、13.65%及15.09%。饲料浸泡时间越长饲料中亮氨酸溶失率越大，在饲喂中应少量多次，以减小亮氨酸的溶失率。

表2 饲料不同浸泡时间的亮氨酸的溶失率 (%)

2.2 饲料亮氨酸水平对青虾血清酶活性的影响 饲料中添加不同水平的亮氨酸对青虾酶活力的影响见图1。饲料中不同水平的亮氨酸对血清中天冬氨酸转氨酶(AST)的活力无显著影响，但对血清中丙氨酸转氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)的活力有显著影响(P<0.05)。没有额外添加亮氨酸的饲料组各种酶活力显著低于其余各组。

图1 饲料中添加不同水平的亮氨酸对青虾ALT酶活力对比

图2 饲料中添加不同水平的亮氨酸对青虾AST酶活力对比

图3 饲料中添加不同水平的亮氨酸对青虾SOD酶活力对比

图4 饲料中添加不同水平的亮氨酸对青虾PO酶活力对比

3 讨论

本试验中，在饲料中添加不同水平的亮氨酸，并测定血淋巴中天冬氨酸转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)和丙氨酸转氨酶(ALT)。青虾亮氨酸最适需要量低于凡纳滨对虾2.46%[5]，但是高于日本对虾[6]、普通鲤鱼[7]、尼罗罗非鱼[8]等的亮氨酸需要量，不同鱼虾对亮氨酸需要有所不同。在本试验中，饲料中不同水平的亮氨酸对血清中丙氨酸转氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)的活力有显著影响(P<0.05)，另外没有额外添加亮氨酸的饲料组各种酶活力显著低于其余各组。综上所述，饲料中亮氨酸的水平对青虾非特异性免疫有显著影响。

[1]王渊源.鱼虾营养概论[m].厦门: 厦门大学出版社, 1993: 10-11.

[2]张凌燕等.配合饲料中不同蛋白质水平对日本沼虾生长的影响[J].上海水产大学学报, 2008(6): 668-673.

[3]孙丽慧, 沈斌乾等.日本沼虾对饲料赖氨酸的需要量研究[J].上海海洋大学学报, 2013.100-104.

[4]王建国, 陆宏达.酚氧化酶活力测定方法中关于测定时间的研究[J].上海海洋大学学报, 2009(6): 765-770.

[5]王用黎.凡纳滨对虾幼虾对苏氨酸,亮氨酸,色氨酸和缬氨酸需要量的研究[D].湛江: 广东海洋大学, 2013, 16-22.

[6]Teshima S, Alam m, S, Koshio S, etal.Assessment of requirement values for essential amino acids in the prawn,marsupenaeus japonicas (Bate)[J].Aquaculture Research, 2002, 33(6): 395-402.

[7]Nose T.Summary report on the requirement of essential amino acids for carp[J].In: Halver J.E., Tiew, K.(Eds.), Finfish Nutrition and Fish diet Technology, Heinemann, Berlin, Germary, 1979, 145-156.

[8]Santiago CB, Lovell RT.Amino acid requirements for growth of Nile tilapia[J].The Journal of nutrition, 1988, 188(12): 1540.