基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌

孙继国韩增叶葛喜珍田平芳

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

基于重组大肠杆菌无细胞体系生产吡咯喹啉醌

孙继国1韩增叶1葛喜珍2田平芳1

（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.北京联合大学生物化学工程学院，北京 100023）

采用无细胞体系生产吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）。首先将肺炎克雷伯氏菌PQQ基因簇pqqABCDEF置于半乳糖苷酶启动子之下，构建表达载体，经转化筛选获得重组大肠杆菌。制备重组菌的细胞匀浆，体外反应后测定PQQ产量。结果显示，与活体重组菌相比，无细胞体系的PQQ产量提高约30%，表明胞内存在PQQ合成的限速反应，而无细胞体系可解除此限速反应。

大肠杆菌 无细胞体系 吡咯喹啉醌 限速反应

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是不同于烟酰胺嘌呤核苷酸（NAD/NADP）和黄素核苷酸（FMN/FAD）的一种新型辅酶，被归类为B族维生素［1］。PQQ分子中含有参与氧化还原反应的邻醌类结构，可作为辅因子参与脱氢、氧化、水合和脱羧等反应［2］。迄今，PQQ主要发现于革兰氏阴性细菌，如肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）和绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）等［3，4］。大肠杆菌（Escherichia coli）不能合成PQQ，但能合成以PQQ为辅因子的酶蛋白［5，6］。肺炎克雷伯氏菌的PQQ合成基因为线性排列的基因簇pqqABCDEF，包括6个阅读框［7］，pqqA负责前体的合成，其余基因产物参与催化或转运。

在大肠杆菌中已成功表达乙酸钙不动杆菌和肺炎克雷伯氏菌的PQQ基因簇，并检测到PQQ的合成［8］。前者的PQQ合成量较低，后者培养基中的PQQ产量达到230 nmol/L，推测是在胞质合成PQQ，然后运输释放到培养基中。乙酸钙不动杆菌的PQQ分泌能力较弱。作为辅因子，PQQ参与多种反应，较难在胞内高度积累，推测是因为存在限速步骤。无细胞体系（cell-free system）是基于不完整细胞或完全不依赖细胞生产目标产物的方法，常用于研究多酶反应的限速步骤，或直接用酶进行体外催化［9］。

利用T7启动子在大肠杆菌中过表达葡萄糖酸杆菌的pqqABCED阅读框，但不能大量合成PQQ［10］，推测胞内存在PQQ合成的限速步骤。本研究用无细胞体系验证限速步骤，旨在探索体外用细胞匀浆合成PQQ。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒与培养条件 肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniaeDSM 2026），大肠杆菌E. coliDH5α及E. coliBL21，以及携带PQQ基因簇的表达质粒pETPQQ由本实验室保存。大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的通用培养基为Luria-Bertani（LB），重组大肠杆菌的培养基为高糖M9培养基，其葡萄糖浓度为1.5%（W/V）。上述两菌的培养温度分别为37℃和30℃（肺炎克雷伯氏菌提供PQQ基因簇），转速为200 r/min，抗生素为硫酸卡那霉素50 mg/L。

1.1.2 主要试剂 PrimeStar聚合酶、ExTaq聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司；PQQ标品购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的构建 以pET28a质粒为骨架，选择BglII和EcoR I为上下游酶切位点，将其自身的T7启动子更换为半乳糖苷酶启动子pLAC（以本实验室构建的pET-PQQ为对照，PQQ基因簇含自身原始启动子）。设计引物如表1所示。PCR克隆pUC19中的lac启动子（用ExTaq聚合酶，PCR参数：95℃5 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30个循环；72℃延伸10 min）。基于T7启动子前面的BglII位点和多克隆位点的EcoR I位点，将T7启动子更换为lac启动子，得到重组载体pET-pLAC。将去掉原始启动子的肺炎克雷伯氏菌PQQ基因簇pqqABCDEF插入其下游。具体方法：以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，PCR扩增5.5 kb的pqqABCDEF基因簇。根据GenBank报道序列设计引物。使用PrimerStar聚合酶，PCR参数：98℃ 3 min；98℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 5 min，共30个循环。用EcoR I和Hind Ⅲ双酶切pET-pLAC，将5.5 kb的PQQ基因簇插入pET-pLAC质粒，构建由pLAC调控的pqq基因簇表达质粒pET-pLAC-PQQ。

表1 试验所用引物

1.2.2 重组菌培养条件 以LB培养基为种子培养基，高糖M9培养基（1.5%葡萄糖）为发酵培养基。大肠杆菌在37℃下培养，转速200 r/min。用种子培养基活化重组菌，按1%菌量转接于发酵培养基。当重组菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的OD600值为0.6时加入诱导剂IPTG，使其终浓度为1 mmol/L。以E. coli（pET-PQQ）为对照，培养72 h，测定PQQ产量（卡那霉素终浓度为50 mg/mL）。

1.2.3 无细胞体系的制备 工程菌经种子培养基过夜活化，按1%菌量转接于发酵培养基。当E. coli（pET-pLAC-PQQ）的OD600值为0.6时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，培养24 h后测OD600。按OD600=1时10 mL菌液量（即OD600×V=10），5 000 r/min离心10 min，加入裂解缓冲液，超声破碎细胞，收集培养24 h的培养基，测OD600后按相同菌量离心，弃上清，用pH7.0的PBS重悬，再次离心，弃上清，以洗去残余培养基，离心后加入15 mL（即OD600×V值的1.5倍）细胞破碎缓冲液，超声破碎，4℃下经5 000 r/min离心10 min，取上清，避光密闭条件下30℃孵育3 h，测定孵育前后的PQQ产量（非酶法测定）。无细胞体系反应条件：30℃，3 h。用于超声破碎的缓冲液成分：pH7.0磷酸缓冲液，0.1%巯基乙醇，0.05% PMSF。超声条件：超声2 s，间隔3 s，功率80 Hz，50次。

1.2.4 PQQ含量与生长速度测定 PQQ含量用非酶法测定［11］；用比浊法测定600 nm下的菌体吸光度，绘制生长曲线。

2 结果

2.1 含LAC启动子载体的构建

超表达基因将造成过重的细胞负荷。因质粒pET28a携带T7强启动子，故需更换为半乳糖苷酶启动子（pLAC，来自pUC19质粒）。PCR产物经电

泳鉴定，符合预期（～500 bp），电泳结果见图1。测序结果表明启动子序列完全正确。

图1 LAC启动子克隆及载体构建示意图

2.2 PQQ基因簇的克隆与重组载体构建

PCR产物经电泳鉴定，符合目的条带大小（～5.5 kb）。

基于EcoR I和Hind Ⅲ两个酶切位点，将5.5 kb的PQQ基因簇插入含LAC启动子的载体，提取质粒，酶切，琼脂糖凝胶电泳结果（图2）表明，不同启动子的PQQ重组质粒构建成功。E. coliDH5α为质粒扩增宿主菌，E. coliBL21为表达宿主菌，载体及菌种见表2。

图2 Lac启动子载体的构建

表2 菌株及重组质粒

2.3 PQQ基因簇的表达

因PQQ基因簇的原始启动子及半乳糖苷酶启动子均非强启动子，且PQQ基因簇本身含有发卡转录抑制结构，因此基因经转录和翻译产生的蛋白较少，从SDS-PAGE难以辨认，故只能从PQQ产量来间接体现基因的表达。

2.4 发酵液中PQQ产量

工程菌经种子培养基过夜活化，在高糖M9发酵培养基中培养72 h后，向E. coli（pET-pLAC-PQQ）加入诱导剂IPTG，用非酶法检测发酵上清液的PQQ含量。结果（图3）表明，E. coli（pET-pLAC-PQQ）与E. coli（pET-PQQ）的PQQ产量基本一致，表明这两种启动子对PQQ产量无明显差异。

图3 两种重组菌的PQQ产量

2.5 工程菌生长曲线

由生长曲线可知，携带PQQ基因的重组菌比对照菌（含空载体pET）提前2 h进入平稳期，系因PQQ基因表达导致了代谢负荷。若扣除该代谢负荷，PQQ的合成促进了菌体生长。进入平稳期后，重组菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的生物量略低于其他菌，可能是添加IPTG造成了细胞毒性。总体来看，重组

菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）与其他菌的生物量基本持平，表明生成的PQQ至少没有抑制大肠杆菌的生长繁殖（图4）。

图4 重组大肠杆菌生长曲线

2.6 无细胞体系培养

2.6.1 无细胞体系破碎条件的确定 细胞破碎条件是影响胞液中酶活的关键因素，因此对常用4种破碎条件进行选择，经过无细胞反应体系后确定条件1为最佳破碎条件（图5）。

图5 细胞破碎条件

2.6.2 无细胞体系孵育条件的确定 因缺乏无细胞体系孵育条件的相关研究，因此研究了PQQ体外反应最佳条件。最终确定反应条件为30℃，避光密封孵育3 h（图6）。

2.6.3 工程菌无细胞体系反应 按照上述方法对工程菌进行无细胞体系反应，反应结束后测定PQQ产量。

测定结果（图7）表明，细胞破碎前后对照菌的PQQ产量没有变化，但重组菌E. coli（pET-pLACPQQ）的PQQ产量却提高了约30%，表明重组菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）的细胞内存在瓶颈反应，从而限制了PQQ的合成。细胞破碎后，其PQQ产量明显增加，表明限速步骤被解除，PQQ合成反应得以继续。

图6 无细胞体系反应条件

图7 重组菌无细胞体系孵育前后的PQQ产量

3 讨论

无细胞体系是提高目标产物产量的重要策略，其本质是解除活细胞内生化反应的限速步骤［9］。本研究构建了合成PQQ的重组大肠杆菌，结果表明更换启动子及优化培养基未能显著提高PQQ产量。考虑到限速反应的存在，建立了无细胞体系。与活细胞合成PQQ相比，重组菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）

经无细胞体系反应后，其PQQ产量提高约30%，表明胞内存在瓶颈反应，无细胞体系可解除此瓶颈。该结果证明了PQQ体外合成的可行性。此外，培养条件、能量与还原力平衡、粗提液成分及酶活性均影响PQQ产量。

本试验的PQQ增产幅度有待提高，表明细胞粗提物无法达到最优效果。若对底物和酶进行纯化，对反应条件进行优化，并充分考虑能量和还原力等因素，可望进一步提高PQQ产量。由于PQQ生物合成机理尚未完全阐明，通常会采用超表达其基因簇或无细胞体系来提高其产量。由于PQQ是葡萄糖脱氢酶的辅酶，推断PQQ通过参与葡萄糖代谢而促进细胞生长。结果显示，PQQ基因的表达导致了代谢负荷，若扣除该代谢负荷，PQQ的合成促进了菌体生长。事实上，有文献［12］报道PQQ能刺激细胞生长，推断PQQ与细胞生长之间存在耦合关系。因此，共表达PQQ基因簇和葡萄糖脱氢酶基因可望促进PQQ的积累。此外，由于PQQ参与多种代谢过程以及其合成机制的复杂性，对PQQ生产菌进行大规模基因组改造，然后进行高通量筛选，不失为PQQ高产育菌的有效策略［13］。随着PQQ合成机理的阐明，其无细胞生产体系也将得以完善。

4 结论

构建了合成PQQ的重组大肠杆菌，结果表明更换启动子及优化培养基未能显著提高PQQ产量。考虑到限速反应的存在，建立了无细胞体系。与活细胞合成PQQ相比，重组菌E. coli（pET-pLAC-PQQ）经无细胞体系反应后，其PQQ产量提高约30%，表明胞内存在瓶颈反应，无细胞体系可解除此瓶颈。培养条件、能量与还原力平衡、粗提液成分及酶活性均影响PQQ产量。

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（责任编辑 马鑫）

Exploiting Cell-free System of Recombinant E. coli to Synthesize Pyrroloquinoline Quinone

Sun Jiguo1Han Zengye1Ge Xizhen2Tian Pingfang1
（1. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029；2. College of Biochemical Engineering，Beijing Union University，Beijing 100023）

In this study, cell-free system was developed to overproduce pyrroloquinoline quinone（PQQ）. The PQQ gene cluster from Klebsiella pneumoniae was subcloned into vector harboring lac promoter and a recombinant Escherichia coli was acquired. Subsequently cell homogenate was prepared which showed ～30% increase of PQQ yield compared with in vivo biosynthesis. Not only revealing the presence of intracellular velocity-limiting reaction（s）that retards PQQ biosynthesis, this study also suggests that cell-free system can address this issue. Hence, this study provides basis for further enhancement of PQQ production.

E. coli Cell-free system Pyrroloquinoline quinine Velocity-limiting reaction

2013-11-25

国家自然科学基金项目（21076013），“973”项目（2012CB725200）

孙继国，男，硕士研究生，研究方向：微生物代谢工程；E-mail：mishiweilan@126.com

田平芳，男，博士，教授，研究方向：微生物基因工程；E-mail：tianpf@mail.buct.edu.cn