面包虾中副溶血性弧菌温度预测模型的建立

贺 群，黄 和，*，刘 亚，蒋志红，励建荣

（1.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2.渤海大学，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

面包虾中副溶血性弧菌温度预测模型的建立

贺 群1，黄 和1，*，刘 亚1，蒋志红1，励建荣2

（1.广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088；2.渤海大学，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州121013）

为探讨面包虾生产过程中副溶血性弧菌的生长规律，测定了不同温度（10、14、18、22、26、30、37℃）下副溶血性弧菌的生长曲线，运用Origin8.0软件和DMFit软件，分别采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型对生长曲线进行拟合，建立初级模型。应用平方根模型对由最适生长模型得出的最大比生长速率进行拟合，建立二级生长预测模型。研究结果表明，通过模型检验比较，修正Gompertz模型模型对7种温度培养条件下的拟合度较好（决定系数=0.9917），进一步拟合所得二级模型拟合度较好（决定系数=0.9687），得到了最适生长方程，可用于10～37℃温度条件下的面包虾中副溶血性弧菌生长预测。

面包虾，副溶血性弧菌，生长模型

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于世界各地温暖的海洋环境中，人类感染的主要临床症状是胃肠炎。自1998年以来，国家食源性疾病监测网的数据显示，副溶血性弧菌引发的食物中毒超过沙门氏菌跃居首位[1]。国内外对副溶血性弧菌预测模型的研究主要集中在初级和二级模型，卢晓凤[2]、田金玲等[3]研究了蛤肉、模拟蟹肉中副溶血性弧菌不同温度条件下的生长规律，Gompertz方程拟合度较高。Zwietering等[4]比较了Gompertz和其他方程后，认为只有修正Gompertz方程更能充分描述细菌生长曲线。姬华等[5]采用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型对肉汤和对虾中副溶血性弧菌的生长曲线进行拟合，发现拟合度都较高。Miles等[6]建立了不同培养条件下肉汤中副溶血性弧菌生长速率的平方根模型，Soon等[7]在Miles等的研究基础上，建立了肉汤和牡蛎匀浆中副溶血性弧菌的生长动力学模型，修正Gompertz方程和平方根模型拟合度都较高。

副溶血性弧菌的感染主要是由于生食或误食未煮熟或加工过程中再污染的海产品，尤其是虾[8]。对虾作为我国水产品出口创汇的拳头产品[9]，在2005年初美国对我国初级冷冻虾类产品开始征收高额反倾销税后，出口严重受阻，面包虾作为一种鲜虾的深加工产品，带动了我国整个虾类产品的出口。面包虾在生产过程中除去低温几乎没有任何的抑菌工序，因此，通过探讨副溶血性弧菌在面包虾表面的生长规律，特别是探讨其在面包虾中不同温度培养条件下的生长模型的构建，对开展副溶血性弧菌的风险评估和完善面包虾加工技术具有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副溶血性弧菌（ATCC17802） 广东省微生物研究所，菌株在含3%NaCl和20%甘油的脑心浸液肉汤（BHI）中于-80℃保存，菌株接种于2.5%NaCl胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，37℃培养箱中培养16～20h，活化3代备用；脑心浸液肉汤（BHI）、TCBS琼脂、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂（2.5%NaCl TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、3%氯化钠碱性蛋白胨水、营养琼脂（NA） 均购自青岛海博生物技术有限公司；NaCl分析纯 广东省光华科技股份有限公司。

LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司；XW-80A旋涡混合器 海门其林贝尔仪器制造有限公司；拍击式均质器 西班牙IUL公司；SPX-250B-Z型生化培养箱（5～50℃，±1.5℃） 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LTI-700型低温恒温培养箱（-20～70℃） 上海爱朗仪器有限公司；电子天平 日本岛津公司；1mL、200μL移液枪 德国Eppendorf公司；BCD-277冰箱 博西华家用电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 将副溶血性弧菌划线接种于TCBS平板，挑取典型绿色斗笠状菌落，接种至含有9mL 2.5%NaCl TSB的试管中，37℃、120r/min培养12h，利用无菌的2.5%NaCl TSB培养基的调节菌液OD600为0.5[5]，用无菌3%NaCl碱性蛋白胨水梯度稀释，选择10-4稀释度作为添加的菌悬液。

1.2.2 实验用无菌面包虾的制备[5，10]将面包虾分装于高压平口袋中，约40g/包，真空包装，面包虾在400MPa、28℃下处理20min。超高压处理后准确称取10g面包虾于无菌均质袋中，加入90mL无菌3%氯化钠碱性蛋白胨水，均质机拍打90s，吸取100μL面包虾匀浆液，采用倾注平板法倒3%NaCl NA和2.5%NaCl TSA平板，37℃培养48h，不长菌代表超高压处理杀死了所有的杂菌。将无菌的面包虾置于-18℃冰箱中备用。

1.2.3 副溶血性弧菌的接种、培养及计数[5]无菌称取10g无菌面包虾置于直径为90mm无菌培养皿中，每份虾仁用无菌枪头均匀接种菌悬液100μL，接种后使面包虾的初始菌数达到101～103cfu/g。

接种完毕后，分别置于10、14、18、22、26、30、37℃生化培养箱中培养。根据培养温度，在选定的时间取出样品采用平板计数法测菌数。

1.2.4 生长模型的建立 一级模型的拟合采用Origin 8.0软件和DMFit软件（http：//modelling.combase.cc/ DMFit.aspx），分别用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型拟合面包虾在不同温度下实际测得的副溶血性弧菌浓度随时间变化的生长曲线，再做对比，选出最适模型，三种模型的方程分别为：

式（1）、式（2）中，logNt是在时间t时菌落计数的对数值[log（cfu/mL）]；A即初始菌量的对数值logN0[log（cfu/mL）]；C是初始菌量和最大菌量之间的差值[log（cfu/mL）]；M是生长速率达到最大值时的时间（h）；B是在时间M时的相对最大生长速率（h-1）。

式（3）中，y0和ymax分别是细菌的初始菌量和最大菌量；μm是最大比生长速率（h-1）；tlag是迟滞期。

修正Gompertz模型、修正Logistic模型生长参数参照姬华等[4]的μm、tlag来计算。

将μm作为温度的函数建立模型，采用Ratkowsky等描述的平方根模型[13]，模型方程为：

式（4）中，μm是最大比生长速率，a是回归系数，Tmin是细菌出现生长的理论最低温度。根据初级最适模型求得μm，将μm和对应的温度代入方程式，拟合出b和Tmin，然后代入原方程，求得二级模型。二级模型采用Origin 8.0软件拟合。

1.2.5 模型的检验 一级模型的拟合优度采用决定系数R2评价。二级模型采用残差平方和（RSS）、平方根误差（RMSE）、偏差因子（Bf）和准确性因子（Af）来评定[12]，表达式如下：

式中，μobs和μpred分别最大比生长速率的观测值和预测值，n为实验次数。

1.2.6 数据处理 对不同时间菌落计数的对数值与初始菌数对数值的差值lg（Nt/N0），采用Origin 8.0软件拟合修正Gompertz方程和修正Logistic方程，用DMFit软件拟合方程，通过比较决定系数R2确定最适模型。

表1 修正Gompertz模型、修正Logistic模型参数及统计分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz model and modified Logistic model

表2 Baranyi模型参数及统计分析Table 2 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi&Robert model

2 结果与分析

2.1 副溶血性弧菌一级生长模型的建立

修正Gompertz模型、修正Logistic模型对副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生长曲线进行拟合，由Origin 8.0软件计算出拟合方程的各个参数，如表1所示。

使用Baranyi模型对副溶血性弧菌在10、14、18、22、26、30、37℃的生长曲线进行拟合，DMFit软件同时还计算出了模型的两个变量生长速率μm和迟滞期tlag以及拟合曲线的标准差s和决定系数R2，所得的参数及统计分析如表2所示。

实验结果表明，修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型拟合，均能得到较高的决定系数，决定系数均值分别为0.9917、0.9882、0.9867，选用修正Gompertz模型得出的参数进一步建立二级模型，以lg（Nt/N0）对时间t作图，副溶血性弧菌的一级模型拟合曲线如图1所示。由图1可以看出，随着温度的升高，微生物的最大比生长速率也随之升高。

2.2 副溶血性弧菌二级生长模型的建立

将不同温度下修正Gompertz模型拟合得到的最大比生长速率μm代入Ratkowsky方程拟合，即得到最

从图2中可以看出，10～37℃温度范围内，副溶血性弧菌的比生长速率的平方根与温度呈线性关系，并随着温度的升高而增加，拟合方程的决定系数R2达到了0.9687。

比生长速率的预测值与实测值的残差平方和（RSS）、平方根误差（RMSE）、偏差因子（Bf）、准确性因子（Af）见表3。大生长速率-温度的二级模型，拟合曲线见图2。

表3 比生长速率的预测值与实测值的统计学分析Table 3 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

从实验结果可以看出，二级模型具有较高的R2和较低的RSS值，表明Ratkowsky平方根模型对生长速率的拟合度较好，通过数学参数检验，比较μm的预测值与实测值，可以计算出偏差因子和准确因子，从上表可以看出，RMSE值较小，预测值和实测值的偏差很小，偏差因子Bf接近于1；准确因子Af也接近于1，表明模型的拟合效果好，准确度高，能很好地预测面包虾中副溶血性弧菌的生长。

图1 在10、14、18、22、26、30、37℃条件下面包虾中副溶血性弧菌的一级生长模型Fig.1 The primary growth model for Vibrio parahaemolyticus in Bread Shrimp at 10，14，18，22，26，30 and 37℃

图2 最大生长速率和温度二级模型拟合曲线图Fig.2 Fitted curve of groeth rate and temperature of the secondary model

3 结论与讨论

本实验研究了10～37℃下面包虾中副溶血性弧菌的生长规律，建立了副溶血性弧菌生长的初级模型和二级模型，修正Gompertz模型较好的拟合了实验数据，这与对虾、牡蛎匀浆中副溶血性弧菌生长曲线的拟合结果相似，由此进一步拟合的平方根模型，拟合度较高，通过数学参数检验得出，RMSE值较低，偏差因子和准确因子均接近于1，验证了本实验建立的模型的可靠性。企业在流通、加工过程中，可以通过此模型对整个生产流程和销售过程的时间进行有效的控制，从而达到更好地控制副溶血性弧菌生长的效果，并可作为面包虾质量安全的有效保证，为面包虾的出口起到保障作用，最终增强在国内外市场上的竞争力。

影响副溶血性弧菌生长的因素有温度、pH、盐度、水分活度等因素，温度是主要的影响因素之一。本实验着重研究了不同温度条件下面包虾中副溶血性弧菌生长规律，建立了可靠的预测模型来描述温度对副溶血性弧菌生长速率的影响，对面包虾的生产销售环节有一定的理论指导意义。今后将就低温储藏、盐度、pH等对面包虾中的副溶血性弧菌生长的影响做进一步的研究，以期能通过多种模型的比较选择来建立完整的面包虾中副溶血性弧菌的预测模型。

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Establishment of growth predictive model of Vibrio parahaemolyticus in bread shrimp

HE Qun1，HUANG He1，*，LIU Ya1，JIANG Zhi-hong1，LI Jian-rong2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Food Safety Key laboratory of Liaoning Province，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

To study the growth law of V.parahaemolyticus in the process of bread shimp，growth curves under different temperatures（10，14，18，22，26，30，37℃，respectively）were determined.The modified Gompertz，modified Logistic and Baranyi models，respectively，were applied to fit the growth curves by Origin 8.0 software and DMFit software，and the primary model was established.The root-squaring model were used to fit the maximum specific growth rates obtained by the optimum growth model for the establishment of the secongary model.Results showed that the modified Gompertz model was more accurate and useful in fitting V.parahaemolyticus growth curves than the modified Logistic and Baranyi&Robert models，respectively（R2= 0.9917）.And the secondary model had a high goodness-of-fit（R2=0.9687）.The optimum growth equations were obtained.The modified Gompertz model coulde be used for predicting the growth of V.parahaemolyticus in Bread Shrimp under above temperature condition.

bread shrimp；Vibrio parahaemolyticus；growth model

TS201.3

A

1002-0306（2014）08-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.010

2013－08－19 *通讯联系人

贺群（1987-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品质量与安全。

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD29B06）；广东省省部产学研结合项目（2011B090400154）；湛江市科技计划项目（湛科[2010]174号）。