多指标综合评价优选丹参提取工艺

赵 辉 王丽萍 陈 琳 张华潭 李春花 黄秀英

1.河北省保定市第一医院，河北保定071000；2.河北医科大学研究生学院，河北石家庄050091；3.河北医科大学中药药剂教研室，河北石家庄050091；4.河北省保定市第四医院，河北保定071000）

多指标综合评价优选丹参提取工艺

赵 辉1王丽萍1陈 琳2张华潭2李春花3黄秀英4

1.河北省保定市第一医院，河北保定071000；2.河北医科大学研究生学院，河北石家庄050091；3.河北医科大学中药药剂教研室，河北石家庄050091；4.河北省保定市第四医院，河北保定071000）

目的优选丹参脂溶性及水溶性成分最佳提取工艺。方法采用正交设计，以丹参酮ⅡA、丹酚酸B为测定指标，用高效液相色谱法测定其含量，并以二者含量为综合指标，加权评分，优选最佳提取工艺。结果最佳提取工艺为：6倍量70%乙醇，提取3次，每次2.5 h。结论优选的提取工艺合理、可行。

丹参；提取工艺；正交试验；丹参酮ⅡA；丹酚酸B

人参强心滴丸由人参、丹参、生地黄、蟾酥四味中药组成，具有益气养阴，活血强心的功效。丹参是其主要组成药味，含有二萜醌类脂溶性及酚酸类水溶性成分。脂溶性成分具有活血化瘀、抗菌、抗急性缺氧、抗心律失常、改善血管平滑肌、抗心肌肥厚、抗血小板聚集等作用；水溶性成分具有抗血小板聚集、抗凝血和抗血栓形成、抑制细胞内源性胆固醇合成、防止脂质沉积及动脉粥样硬化斑块等作用[1-2]。目前，对丹参提取研究往往侧重于一类成分，同时考虑到两类成分的研究较少，本研究为提高人参强心滴丸的临床疗效，兼顾丹参脂溶性及水溶性两类有效成分，以丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量为考察指标，对丹参的提取工艺进行全面优选。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），VWD紫外检测器（美国安捷伦科技公司），Agilent Chemstation System色谱工作站（美国安捷伦科技公司），安捷伦柱温箱（美国安捷伦科技公司，型号：G1316A），METTLER十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试剂与药材

丹参酮ⅡA（批号：110766-200518）和丹酚酸B（批号：110562-200504）对照品均购于中国药品生物制品检定所，丹参药材购于石家庄乐仁堂药店，经侯芳洁老师鉴定符合《中国药典》2010年版一部相关项下规定，乙腈（色谱纯，美国Grace公司，批号：10102501），甲醇（色谱纯，德国Fisher Scientific公司，批号：061495-053786），娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 丹参酮ⅡA色谱条件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流动相：甲醇-水（80∶20），流速：1.0 mL/min，检测波长：270 nm[3]，柱温：室温，进样量：20μL。

2.1.2 丹酚酸B色谱条件

Agilent ZORBAXDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm），流动相：乙腈-甲醇-甲酸-水（10∶30∶1∶59），流速：1.0 mL/min，检测波长：286 nm，柱温：室温，进样量：20μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备[4]

2.2.1.1 丹参酮ⅡA取经五氧化二磷减压干燥24 h的丹参酮ⅡA对照品约20 mg，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，得丹参酮ⅡA对照品储备液。

2.2.1.2 丹酚酸B取经五氧化二磷减压干燥24 h的丹酚酸B对照品约18 mg，精密称定，置100 mL棕色容量瓶中，75%甲醇定容，得丹酚酸B对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备

称取丹参药材10 g，以8倍量70%乙醇提取两次，时间分别为1.5、1 h，滤过，合并提取液，浓缩至近干，加甲醇定容至250 mL，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性实验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。结果表明，对照品溶液和供试品溶液色谱图相应位置上有相同保留时间的色谱峰，且紫外吸收光谱图一致，吸收峰与其他色谱峰能达到基线分离，且峰形稳定。理论塔板数按丹参酮ⅡA峰、丹酚酸B峰计算均不低于5000。见图1。

2.3.2 标准曲线的制备

2.3.2.1 丹参酮ⅡA精密移取对照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，作为标准溶液，测定标准溶液及丹参酮ⅡA对照品储备液峰面积。以丹参酮ⅡA浓度（X，mg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程：Y=49 592 086.0080X-44 976.6300（r=0.9999，n=7），结果表明：在0.021～0.210 mg/mL范围内，丹参酮ⅡA的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3.2.2 丹酚酸B精密移取对照品溶液1、2、3、4、6、8 mL分别置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，作为标准溶液，测定标准溶液及丹酚酸B对照品储备液峰面积。以丹酚酸B浓度（X，mg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程：Y=10 425 847.2879X-1375.0068（r=0.9993，n=7），结果表明：在0.0192～0.192 mg/mL范围内，丹酚酸B的峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验

分别取丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品溶液，按相应色谱条件，连续进样6次，记录丹参酮ⅡA、丹酚酸B的峰面积，丹参酮ⅡA峰面积的RSD为0.86%（n= 6），丹酚酸B峰面积的RSD为0.94%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

图1 丹参酮ⅡA对照品、丹参样品、丹酚酸B HPLC色谱图

2.3.4 稳定性实验

分别取丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品溶液和样品溶液，按相应色谱条件，在0、2、4、8、12、24 h进样，记录丹参酮ⅡA、丹酚酸B的峰面积，结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B峰面积的RSD分别为1.24%（n=6）、1.11%（n=6）和1.03%（n=6）、0.98%（n=6），表明丹参酮ⅡA、丹酚酸B溶液和样品溶液在24 h内均稳定。

2.3.5 重现性实验

称取丹参药材6份，每份10 g，按“2.2.2”项下制备6份供试品溶液，进行含量测定，结果丹参酮ⅡA与丹酚酸B含量的RSD分别为1.61%（n=6）、1.34%（n=6），表明该方法重现性良好。

2.3.6 加样回收率

精密移取已知含量的供试品溶液9份，3份为一组，分别添加丹参酮ⅡA与丹酚酸B对照品储备液1.85、2.30、2.75、3.40、4.25、5.10 mL，测定，结果丹参酮ⅡA与丹酚酸B平均回收率分别为100.06%、99.69%，RSD分别为0.3226%（n=9）、0.4935%（n=9）。表明该方法测定丹参中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量准确、可靠。见表1、2。

表1 丹参酮ⅡA加样回收率

表2 丹酚酸B加样回收率

2.4 正交试验设计[5-6]

确定乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为4个考察因素，采用L9（34）正交表安排实验，以丹参酮ⅡA、丹酚酸B含量为指标，运用加权评分法对丹参的提取工艺进行优选。因素水平表见表3，正交实验见表4。

表3 因素水平表

表4 正交实验结果

2.5 结果分析

由正交表可知，各因素影响大小顺序为D＞A＞C＞B，即提取次数＞乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。最佳提取工艺为A3B2C2D3，即6倍量70%乙醇提取3次，每次2.5 h。

2.6 最佳工艺验证

根据正交实验结果，按丹参最佳提取工艺，提取三批药材，测定，结果丹参酮ⅡA含量分别为2.52、2.54、2.58 mg/g；丹酚酸B含量分别为4.29、4.27、4.34 mg/g；两种成分含量综合评分，在九组试验中皆为最高，说明本次正交实验所筛选的工艺是合理的。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

本研究采用平行试验法对提取溶剂进行筛选，以水、10%、30%、50%、60%、70%、85%、95%乙醇为提取溶剂。结果表明乙醇浓度越高，测得丹参酮ⅡA的含量较高；乙醇浓度越低，测得丹酚酸B含量较高。兼顾二者，根据平行试验结果确定60%、70%、80%三个水平进行正交实验。

3.2 溶液的储存

丹参酮ⅡA具有不稳定性，易发生化学降解，降解速度与水、热密切相关[6-10]且对光不稳定。故其对照品溶液及供试品溶液均应避光放置，且操作宜迅速、避光，以免分解。

3.3综合评分的确定[11-12]

丹参中主要含有两类有效成分，一类是以丹参酮ⅡA为代表的脂溶性成分，另一类是以丹酚酸B为代表的水溶性成分，两类成分所产生的功效对于人参强心滴丸都有重要意义，为此，笔者采取正交试验综合评分优选最佳工艺。由于药材中丹酚酸B的含量约为丹参酮ⅡA的2倍，故在加权评分时，将所测丹酚酸B含量除以2，以使两者在评价系统中所占权重尽量一样，保证了评分的合理性。

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Multi-index evaluation of integration technique for extracting of Salvia Miltiorrniza

ZHAO Hui1WANG Liping1CHEN Lin2ZHANG Huatan2LI Chunhua3HUANG Xiuying4
1.The First Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China;2.College of Past-graduate,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;3.Teaching and Research section of Chinese Medicine Pharmaceutical,Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang 050091,China;4.The Fourth Hospital of Baoding City,Hebei Province,Baoding 071000,China

ObjectiveTo optimize an integration technique for extracting the liposoluble and water-soluble components of Salvia.MethodsSalvianolic acid B and TanshinoneⅡA were selected as marker components and determined by HPLC to optimize the integration extract process of Salvia by orthogonal test.ResultsThe best extraction process was that,Salvia was added with 6 times alcohol of 70%and extracted 2.5 hours for 3 times.ConclusionThis extraction method can be employed to reduce time,working and be suitable for the morden production.

Salvia Miltiorrniza;Integration technique for extracting;Orthogonaltest;TanshinoneⅡA;Salvianolic acid B

R283

A

1673-7210（2014）03（b）-0101-04

2013-06-18本文编辑：卫轲）

河北省卫生厅中医、中西医结合科研计划项目（编号2008004）。

李春花，教授，硕士生导师；研究方向：中药制剂新技术新方法。