SUMO化修饰对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞IκB/NF-κB信号的影响

黄 炜，徐 玲，徐 勇，周雪琴，彭 娟

(泸州医学院附属医院内分泌科，四川泸州646000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病特有而常见的微血管并发症，其发病机制不清。研究表明，以单核-巨噬细胞激活为特征的慢性亚临床炎性反应贯穿于DN 发生发展始终，肾小球系膜细胞在此病理过程中扮演着重要角色［1］。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号是目前公认的介导炎性反应的主要信号通路。IκBα 的磷酸化、继而泛素化降解是NF-κB 信号激活的关键步骤［2］。SUMO 化修饰是与泛素化类似的蛋白质翻译后修饰形式，最近的研究显示，SUMO 化修饰也参与了对NF-κB 信号通路的调节［3］。SUMO 化修饰能否通过影响IκBα 的泛素化降解、激活，NF-κB 信号参与DN 的发病尚未见文献报道。为此，本研究观察高糖刺激后大鼠肾系膜细胞SUMO 蛋白与IκBα 蛋白的相互作用，以及IκBα、NF-κB P65 的表达，旨在探讨SUMO 化修饰在DN 发病中的作用，为DN 的防治提供新理论。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1，中国典型培养物保藏中心);兔抗大鼠SUMO1 单克隆抗体(Abcam 公司);兔抗大鼠SUMO2/3 多克隆抗体(Millipore 公司);小鼠抗大鼠IκBα 单克隆抗体和兔抗大鼠、NF-κB P65 单克隆抗体(Cell Signaling Technology 公司)和兔抗大鼠α-Tubulin 单克隆抗体(Abcam 公司)，小鼠抗大鼠GAPDH 抗体(碧云天生物技术有限公司)，免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒(Pierce 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和实验分组:HBZY-1 细胞常规培养于含10%小牛血清的低糖DMEM 中，培养条件为37 ℃、5% CO2。对数增殖期细胞用于实验，随机分设1)对照组(NC 组):低糖(含葡萄糖5.6 mmol/L)培养基;2)高糖干预组(HG1、HG2 和HG3 组):培养基分别含葡萄糖10、20 和30 mmol/L;3)渗透压对照组(OP 组):培养基含5.6 mmol/L 葡萄糖和24.4 mmol/L 甘露醇;4)MG132 干预组:培养基含30 mmol/L 葡萄糖和1 μmol/L MG132;分别作用6、12、24、48 和72 h 后收获细胞。

1.2.2 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation):将细胞随机分为:对照组(NC)、20 mmol/L 高糖组(HG2)、渗透压对照组(OP)、正常IgG 阴性对照组(IgG)，分别在含上述不同干预因素的培养基中培养。按试剂盒要求加入含蛋白酶体抑制剂的IP 裂解液，定量加入小鼠抗大鼠IκBα 单克隆抗体(NC、HG2 和OP 组)和正常大鼠IgG 抗体(IgG 组)，4 ℃轮转摇晃充分孵育。将蛋白-抗体复合物移入离心柱取并加入含蛋白A/G 琼脂糖，密封轮转孵育1 h;离心洗脱琼脂糖，将免疫沉淀产物煮沸变性后行免疫印迹(Western blot)分析，用兔抗大鼠SUMO1 单克隆抗体(1∶800)，兔抗大鼠SUMO2/3 多克隆抗体(1∶600)一抗孵育检测SUMO 蛋白与IκBα 蛋白间相互作用。

1.2.3 免疫印迹(Western blot)法:取细胞加蛋白抽提液，加样品电泳，转膜，封闭，分别在相应分子量的PVDF 膜上孵育小鼠抗大鼠IκBα 单克隆抗体(1∶1 000)，兔抗大鼠、NF-κB P65 单克隆抗体(1∶1 000)，小鼠抗大鼠GAPDH 单克隆内参抗体(1∶2 000)，兔抗大鼠 α-Tubulin 单克隆抗体(1∶3 000)，4 ℃过夜，PBST 洗膜后分别用HRP 标记的二抗孵育1 h，化学发光显影。以IκBα、NF-κB P65蛋白与内参GAPDH，α-Tubulin 蛋白条带平均吸光度值之比表示IκBα、NF-κB P65 蛋白含量。

1.3 统计学分析

用SPSS17.0 统计软件分析数据，数据以均数±标准差(±s)表示，各组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q 检验。

2 结果

2.1 高糖特异性减弱肾系膜细胞IκBα 的SUMO化修饰

20 mmol/L 高糖(HG2)组在约60 ku 处出现SUMO1-IκBα 结合条带(图1A)及SUMO2/3-IκBα 结合条带(图1C)，同时，IgG 对照组在相应蛋白分子位置未显现蛋白条带。与NC 组比较，HG2 组与OP 组SUMO1-IκBα 结合蛋白表达明显减少(P＜0.05)(图1B);与NC 组及OP 组比较，HG2 组SUMO2/3-IκBα结合蛋白表达明显减少(P＜0.05，图1D)。

2.2 高糖促进肾系膜细胞IκBα 降解

与NC 组比较，随高糖作用时间延长，各组系膜细胞IκBα 蛋白表达均减弱(P＜0.05)(图2A);其中30 mmol/L 葡萄糖作用72 h 后系膜细胞IκBα 蛋白表达最弱。不同浓度高糖干预系膜细胞24 h 后，与NC 组与OP 组比较，IκBα 蛋白表达量随糖浓度增加而降低(P＜0.05)(图2B)。加入蛋白酶体抑制剂MG132 后，高糖介导的IκBα 泛素化降解被部分逆转(P＜0.05)(图2C)。

图1 免疫共沉淀检测肾系膜细胞IκBα SUMO 化修饰Fig 1 IκBα is sumoylated by SUMO was detected by Co-immunoprecipitation (Co-IP)

2.3 高糖激活、NF-κB

与NC 组比较，高糖干预24 h 后，随糖浓度提高，NF-κB P65 蛋白表达逐步增加(P＜0.05)(图3)。

3 讨论

糖尿病既是以高血糖为特征的代谢性疾病，也是一种全身性、慢性低度炎性反应疾病［4］。NF-κB信号是介导炎性反应最主要的通路，IκBα 的泛素化降解活化NF-κB 转位入核，是NF-κB 信号经典途径激活的必要条件。本研究中发现:高糖呈浓度/时间依赖性地减弱肾系膜细胞IκBα 蛋白表达，蛋白酶体抑制剂MG132 可以部分反转高糖介导的IκBα 泛素化降解，同时高糖又呈浓度依赖性地增强NF-κB P65 蛋白的表达。因此，结合文献，推测高糖可以通过激活泛素-蛋白酶体途径降解IκBα 蛋白，激活NF-κB 信号，参与肾脏慢性炎性反应病变的发生［5］。

鉴于NF-κB 信号在DN 发病中起重要作用，阻断高糖介导的NF-κB 信号活化，成为防治DN 的重要课题。研究显示，使用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132 等不能完全阻断DN 时NF-κB 信号通路的活化，这表明蛋白的其他修饰途经可能也参与了这条通路的激活［6-7］。

图2 Western blot 检测不同时间/浓度高糖及MG132 作用后IκBα 表达Fig 2 Western blot detected the expression of IκBα after various glucose concentrations and times high glucose challenge and MG132

与泛素化介导的蛋白降解不同，SUMO 化修饰是通过蛋白-蛋白相互作用而赋予靶蛋白新的生物特性，从多种层面动态地影响细胞信号传导及相关靶基因的转录和翻译，可能参与多种疾病的病理生理改变。目前已发现SUMO 存在4 个亚型，SUMO2与SUMO3 氨基酸序列非常接近，常合写成SUMO2/3。不同亚型SUMO 蛋白在组织分布和细胞结构中的定位不同，其功能也不尽相同:SUMO1 在生理状态下参与蛋白修饰;SUMO2/3 则主要修饰应激蛋白，参与渗透压、氧化应激和DNA 损伤等介导的病理生理改变［8］。

IκBα 是在NF-κB 信号通路调节中被发现的第一个SUMO 修饰蛋白。IκBα 主要的SUMO 化位点是K21，该位点同时也是IκBα 发生泛素化修饰的位点［9］。有研究发现SUMO1 可修饰IκBα 对抗泛素化介导的NF-κB 信号激活，而SUMO-2/3 亦可与IκBα 共价结合促进低氧诱导的NF-κB 激活［10-11］。本研究证明，高糖可特异性诱导减弱SUMO2/3 与IκBα 的相互作用，与高渗透压因素无关。类似研究证明，通过低氧-再给氧循环刺激腺苷信号，可以募集SUMO，增强IκBα SUMO 化修饰，阻滞其发生磷酸化和泛素化降解，进而减弱NF-κB 的激活和NF-κB信号介导的基因转录［12］。推测正常条件下，SUMO 可能竞争性地占据IκBα 泛素化位点，抑制IκBα 的降解，抑制NF-κB 信号的过度激活;高糖刺激特异性地减弱了肾系膜细胞IκBα 的SUMO 化修饰，导致其泛素化降解增强，进而放大NF-κB 信号参与肾脏炎性反应。

图3 不同浓度高糖作用后NF-κB P65 表达Fig 3 The expression of NF-κB P65 after various glucose concentrations challenge were detected by western-bolt(±s，n=3)

综上，本研究发现了高糖刺激肾系膜细胞NF-κB信号活化的又一重要机制:即高糖可能通过特异性地减弱SUMO2/3 与IκBα 的相互作用，促进IκBα泛素化降解并上调NF-κB P65 表达，活化NF-κB 信号。该机制可能参与了糖尿病肾病的发病。

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