RNA干扰特异性靶向抑制兔滑膜细胞TNF-α表达

唐 强，廖 琦，郝 亮，蔡 风，彭源祥，刘春龙

(南昌大学第二附属医院骨科，江西南昌330006)

创伤后关节炎是继发于高能量关节创伤的骨性关节炎，即便目前有先进的外科干预，仍有40%经历过严重关节创伤的患者最终发展为骨性关节炎，其基因治疗关注度越来越高。研究认为TNF-α 是创伤后关节炎性病理进程中加重软骨破坏和基质降解最重要的炎性细胞因子之一［1］。

RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA 诱发的基因沉默，是高效阻断哺乳动物细胞内基因表达的最有效方法。慢病毒载体感染效率高，能在传代细胞中稳定表达，对静止期细胞亦有较高转染效果。目前利用RNAi 沉默TNF-α 表达的研究报道很少，本研究采用RNAi 方法，构建针对兔TNF-α 的重组慢病毒，探讨其抑制兔创伤后关节炎滑膜细胞中TNF-α 基因的表达，进而为创伤后关节炎的的基因治疗开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂:GV118 慢病毒3 质粒载体系统(上海吉凯基因公司);Lipofectamine 2000 试剂和Trizol 试剂(Invitrogen公司);293T 细胞系和兔创伤后膝关节炎滑膜细胞(本实验室原代获取);Real-time PCR 试剂盒(Toyobo 公司，QPS201);反转录试剂盒(Promega 公司);PRISM® 7500 Sequence Detection System(ABI 公司);培养基(Gibco 公司):DMEM-F12和胎牛血清(Hyclone 公司):20%;青链霉素(碧云天公司):1%无蛋白干细胞用冻存液(赛业生物科技公司)，细胞上清液TNF-α ELISA 检测试剂盒(BD 公司)。

1.2 方法:1)siRNA 的设计与合成siRNA 由锐博生物科技有限公司设计、合成，序列如下:TNF-α-siRNA-A 靶序列5'-GCCTTCAGAACTCCATTCTCAGA-3'，正义链:5'-GCCUUCAG AACUCCAUUCUCAGAdTdT-3'，反义链:3'-dTdTCGGAAGUC UUGAGGUAAGAGUCU-5';TNF-α-siRNA-B 靶序列5'-TGGT GATTATTGATTATTTATTA-3'，正义链:5'-UGGUGAUUAUUG AUUAUUUAUUAdTdT-3'，反义链:3'-dTdTACCACUAAUAAC UAAUAAAUAAU-5';TNF-α-siRNA-C 靶序列5'-CACGTTTTC CGTGAAAACAGAGC-3'，正义链:5'-CACGUUUUCCGUGAAA ACAGAGCdTdT-3'，反义链:3'-dTdT GUGCAAAAGGCACUUU UGUCUCG-5'。2)细胞培养原代细胞取自构建的兔创伤后膝关节骨性关节炎模型，获取原代细胞后，使用多聚赖氨酸处理细胞培养瓶培养表面，采用DMEM-F12 培养液(含20%胎牛血清和1%青-链霉素)，37 ℃、5% CO2恒温孵育箱孵育，常规用0.25%胰蛋白酶消化传代，用第3～6 代处于对数增殖期滑膜细胞进行实验。3)重组慢病毒构建与包装构建如下反应体系合成TNF-α-siRNA-A:10 ×缓冲液2 μL，上下游引物各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加入超纯水补足20 μL，合成oligo片段，按GV118 慢病毒3 质粒载体系统试剂盒说明，将载体线性化后纯化吸收，与上述合成的oligo 片段连接后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆后扩增提取DNA 片段，线性化后利用Lipofectamine 2000 试剂转染293T 细胞进行慢病毒包装并进行滴度测定。同理构建并包装另外两组重组慢病毒。4)重组慢病毒感染滑膜细胞感染前1 天将滑膜细胞以1 ×105细胞/孔接种至12 孔细胞培养板中。每孔中加入不含抗生素的培养基，待细胞汇合度达到70%～90%时进行感染，结果分为4 组:NC(阴性对照)、siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C，将上述3 组实验病毒液同等剂量以最佳感染指数(MOI=20)感染对应组滑膜细胞，NC 组加入等量蒸馏水。培养8～12 h 后，观察细胞状态，更换新鲜完全培养基。置培养板于37 ℃的CO2培养箱中培养48 h。5)Real-time PCR检测TNF-α mRNA 表达水平提取细胞总RNA:严格按照说明书使用TRizol 试剂裂解细胞并提取细胞总RNA。按说明书进行反转录反应，所有操作在冰浴条件下进行，20 μL 反应体系彻底混合后，30 ℃孵育10 min，42 ℃孵育60 min，72 ℃孵育10 min，然后使用Real-time PCR 试剂盒进行荧光定量PCR 反应(方法依照使用说明)。冰浴条件下操作，引物彻底混合后放入仪器:ABI PRISM® 7500 Sequence Detection System，使用软件7500 software v2.0.6 分析，反应程序如下:95 ℃1 min，95 ℃15 s，62 ℃30 s(收集荧光信号)，40个循环，60 ℃，所有反应设3 个复孔反应，结束后确认荧光定量PCR 的扩增曲线和熔解曲线，结果采用相对定量法分析，目的基因相对表达量利用2－ΔΔCt法进行计算。6)ELISA 检测细胞上清液TNF-α 收集上述转染48 h 后细胞上清液，按BD 公司TNF-α ELISA 试剂盒说明书严格操作。使用试剂盒提供的标准品按说明书稀释制作标准曲线，每个样品进行3 复孔检测。

2 结果

2.1 TNF-α-siRNA 重组慢病毒构建与包装:成功构建3 组重组慢病毒，经检测序列与预期DNA 序列相符，说明合成的TNF-α-siRNA 沉默序列插入正确，重组成功，可以进行后续实验(测序经由上海生工生物完成)。慢病毒感染293T 细胞72 h后荧光显微镜观察可见绿色荧光表达(图1)，siRNA-A、siRNA-B 和siRNA-C 组病毒滴度分别为4.12 ×108、4.25 ×108和4.03×108TU/mL，均满足慢病毒RNAi 后续实验要求。

图1 重组慢病毒感染293T 细胞72 h 后荧光分布Fig 1 Fluoresence distribution of recombinant lentivirus infected in 293T cells 72 hours postinfection(×100)

2.2 滑膜细胞TNF-α mRNA 表达水平:感染48 h 后，siRNAA 组与siRNA-C 组滑膜细胞TNF-α mRNA 表达较对照组均受到明显抑制，分别减少55%和65%(P＜0.01)(表1)。

2.3 细胞上清液TNF-α 定量测定的结果:感染48 h 后，siRNA-A组与siRNA-C 组滑膜细胞上清液中TNF-α 表达较之对照组明显减少(P＜0.01)(表1)。

表1 重组慢病毒感染后滑膜细胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表达Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

表1 重组慢病毒感染后滑膜细胞分泌TNF-α及TNF-α mRNA 表达Table 1 The secretion of TNF-αand expression of TNF-α mRNA in synovial cells infected by recombinant lentivirus(±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with control.

groupTNF-α(pg/mL)TNF-αmRNA control153.5 ±0.61.00 ±0.00 siRNA-A90.2 ±1.1*0.45 ±0.03*siRNA-B152.5 ±2.11.10 ±0.17 siRNA-C88.9 ±0.5*0.34 ±0.06*

3 讨论

基因组学研究显示，TNF-a 基因组区间与创伤后骨关节炎关系密切［2］，在应用动物构建的创伤后骨性关节炎性反应模型中，发现早期关节滑液中几乎全部可检测出TNF-α，并且患侧滑液中TNF-α 的含量高出健侧数倍［3］。目前利用RNA 干扰阻断TNF-a 表达进而观察对滑膜细胞作用效果的研究报道很少。

本研究利用慢病毒载体体内表达稳定、安全性好的特点，在构建兔创伤后骨性关节炎模型的基础上，针对兔TNF-α基因序列成功设计并合成3 组siRNA，并进一步合成了相应重组慢病毒，将重组慢病毒感染滑膜细胞后测定滑膜细胞中TNF-α 基因的表达，显示有2 组滑膜细胞TNF-α mRNA 表达明显下降，同时细胞上清液中TNF-α 表达亦明显受到抑制。虽然siRNA 最有效作用靶点仍有待进一步研究，但本研究证实合理构建的重组慢病毒感染滑膜细胞后能靶向抑制细胞TNF-α 的表达，为临床以TNF-α 为靶点的创伤后关节炎基因沉默治疗提供了新的方向。

［1］Anderson DD，Chubinskaya S，Guilak F，et al.Post-traumatic osteoarthritis:Improved understanding and opportunities for early intervention［J］.J Orthop Res，2011，29:802-809.

［2］Loughlin J.The genetic epidemiology of human primary osteoarthritis:cuurent status［J］.Expert Rev Mol Med，2005，7:1-12

［3］Aizawa T，Kon T，Einhorn TA，et al.Induction of apoptosis in chondrocytes by tumor necrosis factor‐alpha［J］.J Orthop Res，2001，19:785-796.