番茄micro-TOM活体再生体系的建立

（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁省植物基因工程技术研究中心，辽宁沈阳110866）

番茄micro-TOM活体再生体系的建立

曹慧颖 王玉莹 孙建坤 刘玲莉 张立军 阮燕晔 夏润玺*

（沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁省植物基因工程技术研究中心，辽宁沈阳110866）

番茄micro-TOM是生物学研究的模式植物，它的离体再生体系对遗传转化及发育生物学研究至关重要。但是micro-TOM组培再生体系费时费力，容易污染。本试验通过对活体植株进行去头去腋芽诱导，建立了高效快捷、不依赖外源激素的番茄micro-TOM活体再生体系，为简化番茄遗传转化奠定了基础，也为植物再生机理研究提供了良好的实验材料。

植物再生；组织培养；再生机理；遗传转化；番茄micro-TOM

植物离体再生体系不仅是获得大量无性繁殖植物和进行基因转化的重要途径，而且亦是研究植物发育问题的主要实验系统之一（关春梅和张宪省，2006）。番茄micro-TOM是一种番茄突变体，它保留了普通番茄作为模式植物的基本特征，但植株矮小，生命周期更短，具有节省研究空间、缩短研究时间的巨大优势，因此番茄micro-TOM比普通番茄更适合应用于功能基因组学研究（刘小花 等，2008）。功能基因组学研究经常与遗传转化相结合，但是micro-TOM组培再生费时费力，容易污染。本试验建立了一种不需要组织培养的活体再生体系，为简化番茄遗传转化奠定了基础；同时活体再生不需要外源激素，也为植物再生机理的研究提供了良好的实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

番茄（Solanum lycopersicum L.）micro-TOM种子购自南京市丰泰园艺种业有限公司。

1.2 番茄活体再生的诱导

将番茄种子催芽后入土，待幼苗3～4片叶时移栽入盆，培养室温度控制在23～28℃，16 h光照。选取健康番茄植株，水平去头，并剔除腋芽，随后的管理中要及时去除肉眼可见腋芽。

1.3 番茄离体再生的诱导

番茄种子消毒后接种于MS培养基中，25℃光照培养箱中光照16 h，培养7 d获得无菌苗。取子叶完全展开、但真叶还未出现的无菌苗，将子叶切成0.5 cm的小段作为外植体，置于含有1μg·mL-1玉米素的MS培养基上，诱导愈伤组织及再生芽。

2 结果与分析

2.1 番茄micro-TOM的活体再生

番茄micro-TOM植株发育到6～8片叶时，只有主枝具有顶端生长点，其他的腋芽极少萌发。顶端生长点去除后（图1-A），叶腋处的腋芽迅速萌发，顶端伤口表面形成一薄层白色硬皮。随着肉眼可见的新生腋芽的剔除，顶端伤口白色部分逐渐缩小，露出稚嫩绿色，绿色部分逐渐隆起形成明显的愈伤组织（图1-B），随后愈伤组织表面分化出大量紫色小点，最终分化形成多个再生芽（图1-C，D）。

在植物发育研究实验室历时4 a的番茄活体再生实践中，大部分去头的主枝伤口都可以成功再生，只有极个别的植株在受到如此严重的生长胁迫后发育停滞。主枝伤口再生丛生芽的同时，许多剔除腋芽的伤口也会萌发丛生芽。而且最初去头去腋芽的时间无论是在番茄的营养生长时期，还是在已经开花的生殖生长时期，均可以实现活体再生，但幼嫩植株的再生能力要高于较老的植株。

图1 番茄micro-TOM的活体再生

2.2 番茄micro-TOM活体再生与离体再生的比较

番茄的离体再生体系通常以子叶或下胚轴为外植体，在外源激素的诱导下，伤口表面首先形成愈伤组织，愈伤组织继而分化丛生芽（曹慧颖 等，2012）。番茄micro-TOM的离体再生过程如图2所示，此过程与活体再生过程相同，先是伤口形成愈伤组织，进而分化丛生芽。但是两个发育过程所需时间却不相同，活体再生愈伤组织形成需要12 d，分化再生芽需要23 d，所需时间明显少于离体再生愈伤组织形成时间（22 d）和分化再生芽时间（25 d）（愈伤组织的形成和分化是一个连续的过程，这里所指的时间是指形成图1和图2所示愈伤组织和再生芽需要的时间），而且活体再生不会发生微生物污染、褐化等问题。

图2 番茄micro-TOM的组织培养

对于两个再生体系的繁殖能力，笔者分别调查了同一批次的培养物中，生长最快的8个个体，芽长大于1.5 cm的再生芽个数活体再生的平均为3.625个，离体再生的为2.125个。但是再生芽在愈伤组织上的发生是源源不断的，如果将已经长成的芽移除，还会有新的芽长大，所以这个结果并不能说明活体再生的繁殖系数高，只能说明在短时间内会得到较多的再生芽。

2.3 番茄micro-TOM活体再生过程中叶片变化

当番茄micro-TOM植株去头去腋芽后，叶腋处的潜伏芽迅速萌发，随着新生腋芽的逐渐剔除，番茄叶片逐渐变成墨绿色。这种变化可能是番茄受到生长胁迫后发生的一种适应性变化。当再生苗长出新叶后，叶片颜色、形态完全正常。将再生苗从老的植株上切除，插入水中即可自然生根，长成一株完整的植株。

3 讨论

番茄的再生体系在基因工程领域具有广泛的应用（王水琦 等，2007；Ehlert et al.，2008；Van et al.，2010），但是这种再生体系仅限于离体再生。离体再生需要根据不同的番茄基因型逐一摸索组织培养条件，这项工作费时费力，时常受到微生物污染的困扰。本试验建立了番茄micro-TOM的活体再生体系，这个体系只需要简单的去头、去腋芽处理，完全不需要外源激素，不受基因型的干扰，简便易行，大大简化了番茄再生的方法。

番茄的遗传转化通常由农杆菌侵染外植体伤口细胞（曹慧颖和郭三堆，2005；曹慧颖 等，2009），然后借助组织培养得到转化苗。对于活体再生体系，也是由植物的伤口产生愈伤组织，进而萌发丛生芽，那么是否可以尝试将农杆菌涂布于植物伤口，然后将抗生素滴加于伤口表面进行抗性筛选，待伤口表面萌发再生芽后，再进行分子检测。该番茄遗传转化方案，不需要组织培养，如试验成功，将大大简化遗传转化工作流程。

植物离体再生由于取材容易，培养条件容易控制，所以一直是植物再生机理研究的理想试材。但是Yin等（2008）在4种不同激素组合诱导水稻愈伤组织分化过程中鉴定出了157种差异表达蛋白质，说明不同激素可以诱导同种外植体再生，但是再生过程的基因表达谱却差异很大。

植物生长过程中受到干旱、冷害、盐、重金属胁迫时，植物内源激素也会发生相应的变化（Xiong et al.，2002；朱延姝和冯辉，2005）；而且组织培养再生中，外源激素的诱导起到了决定性的作用（叶兴国 等，2012）；同时Tezuka等（2011）报道在番茄去头伤口上施加激素对活体再生具有促进作用。据此笔者推测在活体再生中内源激素含量可能也相应地发生了变化，而且这种激素变化完全是由植物自身调控的，因此番茄活体再生体系是研究植物再生机理的一个良好材料。

曹慧颖，郭三堆．2005．人乳铁蛋白基因在番茄中的优化表达．园艺学报，32 （6）：1030-1033.

曹慧颖，张锐，郭三堆．2009．串联的人胸腺素α1 基因在番茄中的高效表达．中国农业科学，42 （7）：2291-2296.

曹慧颖，张立军，夏润玺，高嵩，王思，张少斌．2012．番茄组织培养研究进展．中国蔬菜，（16）：1-6.

关春梅，张宪省．2006．植物离体器官发生控制机理研究进展．植物学通报，23 （5）：595-602.

刘小花，张岚岚，朱长青，陈昆松，徐昌杰．2008．Micro-Tom番茄矮化微型机制及其在植物功能基因组学研究中的应用．遗传，30 （10）：1257-1264.

王水琦，陈坚，林忠平．2007．超敏反应辅助蛋白基因 （hrap） 转化番茄的研究．园艺学报，34 （2）：377-380.

叶兴国，佘茂云，王轲，杜丽璞，徐惠君．2012．植物组织培养再生相关基因鉴定、克隆和应用研究进展．作物学报，38 （2）：191-201.

朱延姝，冯辉．2005．弱光胁迫下番茄苗期功能叶片内源激素含量的变化．东北师大学报：自然科学版，37 （3）：77-80.

Ehlert B，Schottler M A，Tischendorf G，Ludwig-Muller J，Bock R．2008．The paramutated SULFUREA locus of tomato is involved in auxin biosynthesis．J Exp Bot，59 （13）：3635-3647.

Van D T，Ferro N，Jacobsen H J．2010．Development of a simple and effective protocol for Agrobacterium tumefaciens mediated leaf disc transformation of commercial tomato cultivars．GM Crops，1 （5）：312-321.

Xiong L，Schumaker K S，Zhu J K．2002．Cell signaling during cold，drought，and salt stress．The Plant Cell，（s）：165-183.

Yin L，Lan Y，Zhu L．2008．Analysis of the protein expression profiling during rice callus differentiation under different plant hormone conditions．Plant Mol Biol，68 （6）：597-617.

Tezuka T，Harada M，Johkan M，Yamasaki S，Tanaka H，Oda M．2011．Effects of auxin and cytokinin on in vivo adventitious shoot regeneration from decapitated tomato plants．HortScience，46 （12）：1661-1665．

Establishment of Tomato micro-TOM Regeneration System in Vivo

CAO Hui-ying， WANG Yu-ying， SUN Jian-kun， LIU Ling-li， ZHANG Li-jun， Ruan Yan-ye， XIA Run-xi*

（College of Biological Science and Biotechnology，Shenyang Agricultural University，Liaoning Provincial Research Center of Plant Gene Engineering Technology， Shenyang 110866， Liaoning，China）

Tomato （Solanum lycopersicum L.）micro-TOM is a model organism for biology study. Its regeneration system in vitro is of vital importance for genetic transformation and developmental biology study. But tomato micro-TOM tissue culture is not only time-consuming and tedious， but also frequently polluted by microorganism. This experiment introduces a new method of regeneration system in vivo by removing axillary and apical buds of tomato. The method has high speed and efficiency， and does not rely on exogenous hormone. It has layed a foundation for simplifying tomato genetic transformation and provided a good material for plant regeneration mechanism study.

Plant regeneration； Tissue culture； Regeneration mechanism； Genetic transformation ；Tomato micro-TOM

曹慧颖，女，博士，讲师，专业方向：植物分子生理，E-mail：497110804@qq.com

*通讯作者（Corresponding author）：夏润玺，讲师，专业方向：植物基因工程，E-mail：xiarunxi@163.com

2014-07-16；接受日期：2014-11-04

国家自然科学基金项目（31300164），教育部博士学科点专项科研基金（20122103120004），沈阳农业大学大学生科技创新资助项目