HPLC同时测定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素含量

高华娟，李希，黄嫣，冯建安，杨华，李远辉

·炮制制剂·

HPLC同时测定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素含量

高华娟1，李希2，黄嫣2，冯建安2，杨华1，李远辉1

目的：建立HPLC同时测定抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的含量方法。方法：采用Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）为色谱柱，以乙腈-水为流动相，线性梯度洗脱，检测波长为250 nm，流速为1.0 mL．min-1，柱温为30℃。结果：淫羊藿苷、芒柄花素进样量分别在0.2760-2.760 μg (r=0.9999）和0.1378-1.378 μg (r=0.9999）范围内与峰面积具有良好线性关系，平均回收率为 98.58% （RSD=1.18%）和 99.32% （RSD=0.41%）。结论：该方法准确，可靠，操作简便，可用于抗骨增止疼片中淫羊藿苷和芒柄花素的质量控制。

]抗骨增止疼片；高效液相色谱法 ；淫羊藿苷；芒柄花素；含量测定

抗骨增止疼片是由淫羊藿、鸡血藤、威灵仙等药材组成的中药复方制剂，本品具有补肝肾，活血，止痛的功效。用于治疗骨质增生，瘀血阻络诸症，疗效显著。淫羊藿是方中君药，具补肾壮阳，强筋骨，祛风湿等功效；鸡血藤为臣药，补血活血，舒筋活络，可治疗腰膝酸痛、肢体麻木、风湿麻痹等。淫羊藿苷和芒柄花素分别是淫羊藿和鸡血藤的主要有效成分[1]。为保证制剂疗效，建立简便、快捷的控制方法，本文参照文献[2～5]，以淫羊藿苷和芒柄花素为定量控制指标，采用HPLC对上述两种成分同时进行含量测定，结果显示方法稳定，简便，可用于本品质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 µm）（美国Agilent公司），DAD检测器（美国Agilent公司），SZ-93型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣仪器厂），必能信超声波清洗器（必能信超声有限公司），BP2110电子天平（Sartorius公司），TU-1901紫外分光(Sartorius公司)。淫羊藿苷对照品（批号0737-9709，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供）、芒柄花素对照品（批号111703-200602，供含量测定用，中国药品生物制品检定所提供），乙腈为色谱纯（美国Fisher公司出品），水为超纯水（自制），甲醇，乙醇，其它试剂均为分析纯，抗骨增止疼片（自制）（批号：130301、130302、130303）

2 方法与结果

2.1 对照品贮备液制备

精密称取芒柄花素对照品6.89 mg，置10 mL容量瓶中，加乙醇适量，超声使溶解，用乙醇稀释至刻度，作为对照品贮备液，得芒柄花素对照品贮备液0.689 mg．mL-1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取淫羊藿苷6.90 mg，置50 mL容量瓶中,和芒柄花素对照品贮备液5mL，加入乙醇稀释至刻度，最终得到含淫羊藿苷对照品0.138 mg．mL-1和芒柄花素对照品0.0689 mg．mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备[6]

取同一批次抗骨增止疼片6片，除去薄膜，研细，取约3 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入70%乙醇10 mL，超声处理30 min，放置至室温，加70%乙醇至刻度，摇匀，经0.45μL微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性溶液制备

按处方比例称取除淫羊藿、鸡血藤外的其余药材，依制备工艺制成缺淫羊藿、鸡血藤阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。

2.5 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；保护柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm);以乙腈(A)-水(B)为流动相，线性梯度洗脱，0～6min（A：25→30），6～15min（A：30→33）；柱温30℃；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL．min-1；进样量：10 µL。淫羊藿苷的理论板数不低于1500，芒柄花素的理论板数不低于3000。

2.6 专属性

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，进样，阴性对照对样品无干扰，色谱图见图1。

图1 抗骨增止痛片HPLC图

2.7 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10、20 µL，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，分别得淫羊藿苷回归方程：Y =1172.1X-0.6021，r=0.9999；芒柄花素回归方程Y =2179.5X-14.394，r=0.9999。结果表明，淫羊藿苷进样量在0.2760-2.760 μg范围内，线性关系良好。芒柄花素进样量在0.1378-1.378 μg范围内，线性关系良好。

2.8 精密度试验

精密吸取“2.3”项下供试品溶液，连续进样5次，结果淫羊藿苷和芒柄花素峰面积值的RSD分别为0.20%和0.17%。结果表明，仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、24、48 h后注入高效液相色谱仪，结果淫羊藿苷和芒柄花素峰面积的RSD分别为1.86%和1.31%，结果表明供试品溶液在48h内的稳定性良好，能够满足含量测定要求。

2.10 重复性试验

对同一批样品（批号130301）分别取样6份，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.5”的测定方法进行测定。结果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分别为0.411 mg/g和0.173 mg/g，RSD分别为1.40%和1.27%，表明该方法的重复性良好。

2.11 再现性实验

取同一批样品（批号130301），分别在不同时间由不同的试验人员按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按“2.5”的测定方法进行测定，结果淫羊藿苷和芒柄花素平均含量分别为0.418 mg/g和0.174 mg/g，RSD分别为1.41%和1.36%。结果表明，本含量测定方法的再现性良好。

2.12 准确度试验

精密称取已知含量的样品（批号为130301，除去薄膜，研细）1.5g，分别加入适量淫羊藿苷和芒柄花素，按前述供试品溶液的制备方法及色谱条件进行测定，结果见表1、表2。

表1 淫羊藿苷回收率试验结果

表2 芒柄花素回收率试验结果

2.13 样品含量测定

取3批抗骨增止疼片按前述拟定的含量测定方法进行测定。结果见表3、表4。

表3 样品淫羊藿苷含量测定结果

表4 样品芒柄花素含量测定结果

3 讨论

用紫外分光光度法，在200-700 nm波长范围内扫描淫羊藿苷和芒柄花素对照品溶液及供试品溶液，结果淫羊藿苷、芒柄花素的最大吸收波长分别是270 nm和250 nm，但在250 nm处淫羊藿苷和芒柄花素分离效果好，故测定波长确定为250 nm。

在试验过程中，考察了甲醇超声提取30 min、70%乙醇超声提取30 min、70%乙醇回流提取1 h的效果，结果表明，用甲醇超声提取后测得淫羊藿苷的含量相较其它2个方法低，芒柄花素含量3个方法相近，因加热回流的方法费时费力，所以最终选择70%乙醇超声提取30 min。

选择合适的流动相梯度对样品有效成分分离起着关键的作用，本实验采用梯度洗脱的方法，可以使淫羊藿苷、芒柄花素和干扰杂质进行有效分离，并同时测定这两个组分的含量，方法简便可行。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:180,306.

[2] 徐菁,周本宏.用HPLC法测定鸡血藤膏中芒柄花素的含量[J].数理医药学杂志,2008,21(6):721.

[3] 尹志峰,刘敬闪,张兰桐.淫羊藿苷的含量测定方法[J].中国医院药学杂志,2003,23(8):493.

[4] 童玉玺,徐德然.HPLC-MS法分析朝鲜淫羊藿有效部位化学成分[J].中国天然药物,2006,1(2):21.

[5] 杨戒骄．柱层析-高效液相色谱法测定乳增宁片中淫羊藿苷含量[J].中国药房,2004,15(9):565.

[6] 杨加域,谭旭霞.反相高效液相色谱法分析中药复方制剂肾宝片中淫羊藿的含量[J].国际医药卫生导报,2006,12(15):99.

（责任编辑: 胡慧玲）

Simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets/

GAO Hua-juan1, LI Xi2, HUANGYan, FENG Jian-an, YANG Hua, LI Yuan-hui//(1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To establish a HPLC method for simultaneous determination of icariin and formonone in kangguzeng Zhiteng tablets. Method:The separation was performed on the Shim-pack VP-ODS column (4.6 mm×150 mm, 5 µm) with acetonitrile-water as the mobile phase. The detection wavelength was at 250 nm, and the fow rate was 1.0 mL．min-1. The column temperature was 30℃. Result:The linear response of icariin ranged from 0.2760 μg to 2.760 μg (r=0.9999). The linear response of formonone ranged from 0.1378 μg to 1.378μg (r=0.9999). The average recovery rates of icariin were 98.58% (RSD=1.18%). The average recovery rates of formonone were 99.32% ,RSD=0.41%. Conclusion:The method is accurate, reliable, simple, and can be used for the quality control of icariin and formonone in kangguzengzhiteng tablets.

kangguzeng Zhiteng tablet; HPLC; icariin; formonone; content determination

R 283.6

A

1674-926X(2014)02-013-03

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都 610031

高华娟（1988-），女，四川彭州人，硕士研究生，主要从事中药新制剂、新剂型研究

Tel:13082171117 Email:845480633@qq.com

李希（1969-），女，主任中药师，硕士生导师，主要从事中药新药、新剂型、新技术的研究

Tel:028-66449601 Email:syslx2003@aliyun.com

2013-08-05