厚朴酚与和厚朴酚HPLC含量测定方法及厚朴提取工艺研究

任虹，何瑶，刘芳，傅超美，王世宇，张慧敏，余佳丽

·炮制制剂·

厚朴酚与和厚朴酚HPLC含量测定方法及厚朴提取工艺研究

任虹，何瑶，刘芳，傅超美，王世宇，张慧敏，余佳丽

目的：比较不同提取溶媒对厚朴中厚朴酚与和厚朴酚含量的影响，研究其提取工艺参数。方法：采用HPLC法测定不同提取液中厚朴酚与和厚朴酚的含量。色谱柱DiamonsilTMC18（250×4.6 mm，5 µm），甲醇-水（78:22）；流速1.0 mL．min-1；检测波长294 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。结果：70%乙醇热回流提取效果最佳。结论：不同提取溶媒对厚朴中厚朴酚与和厚朴酚含量有影响，70%乙醇热回流提取法最好，为厚朴及其复方制剂提取工艺的规范化奠定基础。

]厚朴；厚朴酚；和厚朴酚；乙醇；提取工艺

厚朴为木兰科落叶乔木厚朴Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干皮、根皮及枝皮[1]，是我国特有的珍贵中药材，被列为我国特有的常用中药材，因资源过度消耗日益枯竭，先后列为国家二级保护中药材和国家二级保护植物[2]，具有燥湿、行气、平喘的作用。其主要化学成分为厚朴酚、和厚朴酚、挥发油类、生物碱类等，具有抑菌、抗肿瘤、抗炎、促进胃肠蠕动等药理作用[3]。厚朴是多种中药复方制剂的组方之一，通过查阅文献可知在中药复方制剂中，厚朴的提取方法多为用60%、70%、95%乙醇为溶媒进行回流法或渗漉法提取，或先提取挥发油，再和其他药味以水共煎几种路线[4～7]，而对其质量评价多以厚朴酚与和厚朴酚总量为指标。本实验以HPLC法测定厚朴酚与和厚朴酚含量，考察60%、70%、95%乙醇三种溶媒热回流提取法，以期为厚朴及其复方制剂提取工艺的规范化奠定基础。

1 仪器与试药

实验所用的仪器包括：Agilent1200高效液相色谱仪（Agilent 1200二极管阵列检测器；四元泵在线脱气系统；Agilent 1200色谱工作站）（美国安捷伦科技有限公司）；DiamonsilTMC18色谱柱（250×4.6 mm，5 µm，美国迪马公司）；Mettler AE240十万分之一电子分析天平（德国Mettler公司）；FA1104万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；厚朴酚（批号：H-004-120113）、和厚朴酚（批号：H-005-111213）均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供；甲醇为色谱纯（美国fisher公司产品）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

厚朴饮片，购于科伦医药贸易有限公司，药材经检查均符合《中国药典》2010年版一部中有关各项规定。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成已知浓度为0.330 mg．mL-1、0.329 mg．mL-1的溶液，即得。

2.2 厚朴供试品溶液的制备

称取厚朴饮片，每组40 g，分别加入60%、70%和95%浓度的乙醇回流提取3次，第一、二次分别加入乙醇200 mL，第三次加入乙醇150 mL，每次回流提取1 h，滤过，合并三次滤液，定容至500 mL。分别精密量取厚朴三种提取液25 mL，置于蒸发皿中挥干，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，即得60%、70%和95%三种不同浓度乙醇溶媒热回流提取的厚朴供试品溶液。

图1 厚朴酚与和厚朴酚色谱图谱

2.3 色谱条件

实验色谱柱为DiamonsilTMC18色谱柱（250×4.6 mm，5 µm，美国迪马公司）；流动相为甲醇-水（78：22）；流速1.0 mL．min-1；检测波长294 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。将厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液、厚朴供试品溶液注入色谱仪，得色谱图，见图1。供试品中的厚朴酚与和厚朴酚能与其他峰达到基线分离，厚朴酚峰保留时间约为13.2 min，和厚朴酚峰保留时间约为8.6 min，分离度均大于1.5。

2.4 标准曲线的制备

将“2.1”项下制备得到的厚朴酚对照品溶液，分别进样4,6,8,10,12,14μL，以厚朴酚峰面积Y1为纵坐标，厚朴酚对照品含量X1为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y1=1433X1－51.83，r=0.9999。结果表明，在1.32～4.62 µg，厚朴酚峰面积与进样量呈良好线性关系。将“2.1”项下制备得到的和厚朴酚对照品溶液，分别进样2，4，6，8，10 μL，以和厚朴酚峰面积Y2为纵坐标，和厚朴酚对照品含量X2为横坐标绘制标准曲线，回归方程为：Y2=1308X2－21.33，r=0.9997。结果表明，在0.66～3.3 µg，和厚朴酚峰面积与进样量呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.1”项下制备得到的厚朴酚、和厚朴酚对照品溶液10 μL，重复进样6次，按“2.3”项下条件测定峰面积。结果厚朴酚峰面积平均值为4682.73，RSD为0.12%；和厚朴酚峰面积平均值为4299.03，RSD为0.13%。表明此法精密度良好。

2.6 重复性试验

分别精密称取厚朴药材6份，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，按“1.2.3”项下条件分别测定厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的含量。厚朴酚平均含量390.33 mg，RSD为1.02%；和厚朴酚平均含量214.34 mg，RSD为1.26%。

2.7 稳定性试验

称取厚朴药材按“2.2”项下方法制成供试品溶液，室温放置，按“2.3”项下条件，分别于0,4,8,12,18,24 h进样。测得厚朴供试品溶液中厚朴酚峰面积平均值为5596.79，RSD为1.93%；和厚朴酚峰面积平均值为2786.65，RSD为2.03%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取5份已知含量的供试品（厚朴60%乙醇热回流提取），分别加入适量厚朴酚对照品、和厚朴酚对照品，按“2.2”项下厚朴供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依法测定，并分别计算回收率，结果见表1、2，此法具有良好的回收率。

表1 厚朴酚回收率试验结果（n=3）

表2 和厚朴酚回收率试验结果（n=3）

2.9 含量测定

取厚朴60%、70%、95%乙醇热回流提取液，制备得到的供试品溶液，分别按“2.3”项下条件进样，对厚朴酚与和厚朴酚进行含量测定，结果见表3。

表3 厚朴中厚朴酚与和厚朴酚含量测定结果（n=3）

3 结论与讨论

实验结果显示，以厚朴酚、和厚朴酚为评价指标，70%乙醇热回流提取效果最好，含量最高。中药有效成分溶出的多少，提取溶媒是关键之一，本实验只通过不同提取溶媒对厚朴中厚朴酚与和厚朴酚溶出的影响进行了研究，但不能仅以这两种成分为指标评价提取溶媒的优劣，应同时引入对提取时间、提取次数以及提取的溶媒量进行考察，并立足于厚朴的物质基础和临床疗效，从中药多成分层面上考虑“谱效关系”[8～11]，建立不同提取方法的指纹图谱，并寻找指纹图谱与疗效的内在关系，建立体现“谱-证-效”的质量控制方法，或者采用HPLC-MS、GC-MS进行研究，寻找厚朴的化学成分变化规律，以更加完善厚朴及其中药复方制剂的提取工艺。

[1] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:235.

[2] 斯金平,童再康,曾燕如,等.厚朴种质资源评价与利用研究[J].中药材,2002,25(2):79.

[3] 刘颖新,刘利利,喻祖文,等.星点设计-响应面法优化厚朴提取溶媒[J].中国实验方剂学杂志,2013,7(19):27.

[4] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准—中药成方制剂第7册[S].北京:人民卫生出版社,1996:205.

[5] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:1234.

[6] 单洪岩.藿香正气片制药溶媒及质量控制研究[D].吉林大学硕士研究生学位论文,2008.

[7] 王凌,周震.加味藿香正气滴丸提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(11):58.

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[9] 曾建红,莫炫永,戴平,等.广西莪术挥发油抗肿瘤作用的谱效关系研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(13):91.

[10] 宋玉超,崔秀荣,连超杰,等.赤芍、白芍凉血作用比较研究(Ⅱ)—抑制脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞凋亡的谱效分析[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(6):181.

[11] 何瑶.谱效结合评价四物汤提取工艺[D].成都中医药大学硕士学位论文,2010.

(责任编辑：胡慧玲)

Study on the HPLC determination of magnolol and honokiol and extraction technology of Houpo/

REN Hong, HE Yao,LIU Fang, FU Chao-mei, WANG Shi-yu, ZHANG Hui-min, YU Jia-li//( Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective:To compare the infuence of different extracting solvent on the content of magnolol and honokiol in Houpo and optimize the extraction parameters. Method:HPLC was applied to determine the contents of magnolia and honokiol in different extracting solvent of Houpo. The samples analysis were performed on a Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 µm) column with mobile phase of CH30H:H20 (78:22),at a fow rate of 1.0 mL．min-1. The column temperature was 30 ℃,and the detection wavelength was set at 294 nm. The injection volume was 5 µL. Result: 70% ethanol was the best extracting solvent for the extraction. Conclusion: Different extracting solvent has infuence on the extraction rate. 70% ethanol thermal circumfuence extraction is good for extraction. The study lays a foundation for the standardization of extraction process of Houpo and its compound preparation.

Houpo; magnolia; honokiol; ethanol; extraction technology

R 283

A

1674-926X(2014)02-009-03

成都中医药大学校基金（编号：ZRYB201111）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

任虹，女，在读硕士研究生，从事中药新制剂和新剂型的研究

Tel:15882232829 Email:363568917@qq.com

王世宇，女，副教授，从事中药新制剂和新剂型的研究 Tel:13708051074

2013-09-30