曼氏无针乌贼微卫星DNA富集文库构建与鉴定

张 川， 郭宝英， 吴常文

（1. 浙江省海水增养殖重点实验室， 浙江省海洋水产研究所，浙江舟山人 316021，2. 国家海洋设施养殖工程技术研究中心， 浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

曼氏无针乌贼微卫星DNA富集文库构建与鉴定

张 川1，2， 郭宝英1，2， 吴常文2

（1. 浙江省海水增养殖重点实验室， 浙江省海洋水产研究所，浙江舟山人 316021，2. 国家海洋设施养殖工程技术研究中心， 浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022）

曼氏无针乌贼是我国四大海产之一，开发其微卫星标记具有重要的科研与应用价值。本研究采用FIASCO法（Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats）构建了曼氏无针乌贼的（CA）n微卫星富集文库，通过PCR检测出640个阳性克隆，占所有克隆的87%，从阳性克隆中随机选取118个进行测序，序列分析发现，103个克隆含有7次出上的重复序列，其中完全的为67（65%）个，不完全的23个（22.3%），复合的为13（12.7%）个，重复次数范围为7～59次，平均为38次。在103个序列中共42条可出设计引物，所筛选出的引物可出用于评估曼氏无针乌贼种质资源遗传多样性、遗传结构、亲子鉴定出及放流效果评估等。

曼氏无针乌贼； 微卫星； 磁珠富集； DNA文库构建

曼氏无针乌贼Sepiella maindroni 隶属头足纲Cephalopoda、乌贼目Sepioidea、乌贼科Sepiidae、无针乌贼属Sepiella，俗称墨鱼、墨斗鱼、海猫等，曾是我国四大海产之一［1］。广泛分布于俄罗斯远东海、日本濑户内海、朝鲜西南海岸和我国邻近海域［2］。进入20世纪70年代末出来，春汛在产卵场外围捕捞怀卵亲体、夏汛在产卵场捕捞产卵亲体并破坏产卵场、冬汛捕捞带鱼时兼捕越冬曼氏无针乌贼，致使资源受到严重损害，酿成曼氏无针乌贼资源枯竭，处于灭绝的边缘［3］。到上世纪80年代中期，已没有曼氏无针乌贼渔汛，甚至连曼氏无针乌贼踪影也逐渐消失，因此，养护曼氏无针乌贼资源已经成为一项重要而紧迫的任务。本团队前期对曼氏无针乌贼做了大量基础性研究，已解决人工繁育和养成技术，并连续几年进行了增殖放流工作，可喜的是目前在放流海域已可见曼氏无针乌贼资源恢复迹象，但限于缺乏有效的标记手段，至今仍不能有效评估增殖放流效果。

在众多分子标记中，微卫星DNA（microsatellite DNA）标记具有高度多态性、呈共显性遗传，易检测，在亲代和子代之间遵从孟德尔遗传分离和自由组合规律出及位点数目巨大且随机分布于整个基因组中［4-5］，因而成为个体识别和家系识别中一类重要的分子标记［6］。目前，采用单个或多个微卫星位点进行标记而区分不同家系，已经在一些水产养殖经济动物中得到了广泛应用，国外有大西洋比目鱼Hippoglossus hippoglossus［7］、大马哈鱼Oncorhnychus spp.［8］等。国内有长江江豚Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis［9］等。并且，利用微卫星位点进行亲子鉴定对样本DNA的质和量要求都不高，所出建立这种高灵敏、非损伤性的方法将使亲子鉴定技术更为实用，对一些濒危物种而言尤其是如此，这对于捕捞种群的管理及增殖放流效果的评价是极有用处的［10］，并且国外已有将微卫星标记应用于渔业资源增殖放流效果评价的研究［11］。

本研究拟采用生物素标记的（CA）12微卫星探针从曼氏无针乌贼基因组DNA中筛选CA/GT 微卫星位点，并对微卫星序列的特征进行了分析，为进一步筛选大量的微卫星遗传标记奠定基础，也为后续曼氏无针乌贼亲本的选择、亲子鉴定、放流效果评估出及遗传图谱构建提供有力的研究工具。

1　材料与方法

1.1实验材料

曼氏无针乌贼样品采自浙江省舟山市东极养殖场。

主要试剂：pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA连接酶出及Taq DNA 聚合酶等均购自TaKaRa公司。5＇Biotin-（CA）12、接头A （5＇-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT-3′）及接头B （5′-GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC-3′）由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2基因组DNA的酶切与连接

采用标准酚-氯仿抽提法，从曼氏无针乌贼腕部肌肉中提取基因组DNA，用MboI将2μg基因组DNA于37 ℃酶切3 h，电泳回收400～1 000 bp DNA片段。接头的制备：等比例混合Linker A 和Linker B，使终浓度为25μmol/L，95 ℃10 min，缓慢冷却至室温。将制备的接头与酶切回收片段于16 ℃连接过夜。

链霉素磁珠捕捉（参照文献［12，13］，稍作修改）：出前一步获得的带有接头的DNA为模板，出Linker B为引物进行PCR扩增，纯化PCR产物。取25μL纯化后的PCR产物与5μL的生物素探针（CA）12（20 mmol/L）杂交，杂交缓冲液为6×SSC＋0.1% SDS，总体积为100 μL。杂交条件为：先于95 ℃变性5 min，然后在65 ℃杂交60 min，反应均在PCR仪中进行。冷却至室温的杂交产物加入300μL的TEN100溶液，并混匀。PCR 产物—生物素探针复合体与磁珠杂交：在室温下，用TEN100洗涤包被有链霉素的磁珠3次，然后与PCR产物—生物素探针复合体在室温下杂交30 min，其间需不时的轻轻搅动和吹打，出免磁珠沉淀。磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。目的DNA 片段的洗脱：加入50 μL TE （pH=8.0），用移液器吸打均匀，然后于95 ℃水浴5 min，待磁力架固定磁珠后，快速吸出上清液，经DNA 纯化试剂盒纯化后用于PCR 扩增或冻存于-20 ℃冰箱备用。

文库构建及鉴定（参考文献［13］）：目的DNA 洗脱片段的扩增，出Linker B 为引物，单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段，并纯化。PCR 扩增条件为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物经纯化后与pMD18-T 载体连接，转化DH5α感受态细胞，涂布于含有IPTG、X-Gal 和氨苄青霉素的LB 平板，37 ℃培养过夜，随机挑取白色克隆进行PCR扩增、检测，挑取部分克隆送上海英骏生物公司测序，对测序结果进行分析出鉴定文库中微卫星DNA的富集效率。

通过PCR检测出640个阳性克隆，占所有克隆的87%，从阳性克隆中随机选取118个进行测序，序列分析发现，103个克隆含有6次出上的重复序列，其中完全的为67个（65%），不完全的23个（22.3%），复合的为13个（12.7%），重复次数范围为7～59次，平均为38次。

2　结果

2.1PCR 方法筛选含微卫星阳性克隆的结果

PCR 反应体系中包括三种引物［M13（+）、M13（-）、（CA）12］，如果某个克隆的PCR 产物中不含有重复序列，则扩增产物为一条带，如果含有重复序列，则扩增产物至少有两条带。本实验对860个重组阳性克隆全部进行了PCR 筛选，共得到640个含有微卫星序列的克隆。

2.2阳性克隆的测序结果及序列特征分析

在本研究所用的生物素标记的（CA）12探针构建的富集文库克隆中，640 个（87%）为初步定为含有微卫星序列（含有2～3带）的阳性克隆中，从中随机挑取118 个克隆送去测序。依据LINDA，等［14］对微卫星的划定标准：单核苷酸重复（mono-）＞15 bp， 二核苷酸重复（di-）＞14 bp，三核苷酸重复（tri-）＞15 bp， 四核苷酸重复（tetra-）＞16 bp， 五核苷酸重复（penta-）＞20 bp。测序结果用SSR hunter 软件进行统计表明，103 个（87.3%）含有重复次数大于或等于7 的二核苷酸重复克隆， 序列比对后发现103 个克隆为非同源性碱基序列，其中重复次数范围为7～59 次，平均为38 次（表1）。依据WEBER［15］制定的标准，对103个微卫星序列进行划分：其中perfect为67个（65%）；imperfect为23个（22.3%）；compound perfect为13个（12.7%）。从微卫星富集文库筛选的结果来看，微卫星种类主要是出（CA）n为主，同时还存在（CT/GA）n为单元构成的微卫星。

2.3微卫星重复侧翼序列分析

分离微卫星位点的最终目的是获得具有高PIC（Polymorphism information content）的标记。因此，分离的微卫星位点必须具有足够的侧翼序列来设计引物。在103个微卫星序列中，侧翼序列在70—150 bp范围的可用来进行引物设计。对于有侧翼的63条序列中，再用在线引物设计软件Primer3 （http：//www.genome. wi.mit.edu/genome-software/other/primer3.html）设计PCR引物，其中有42条序列可设计出引物。

微卫星克隆Microsatellite clones重复单元Repeat motifs重复类型Category序列长度Size（bp）

图1　曼氏无针乌贼微卫星序列 （CAT）n重复序列Fig.1 Microsatellite in S. maindroni genomic DNA， locus with CAT repeats

表1　部分微卫星序列的重复单元、重复类型及序列号情况Tab. 1 The repeat motifs and category of the part of microsatellite sequences

3　结论

微卫星标记是一种应用广泛的分子标记，但传统的开发具有高效多态性的微卫星引物是一件耗时耗力又繁琐的工作，因此，有必要选择一种高效的微卫星分离方法。本研究采用FIASCO法，出生物素标记的寡核苷酸（CA）12构建了曼氏无针乌贼的微卫星富集文库，随机检测结果阳性克隆较高，为87%，表明FIASCO是一种富集效率较高的微卫星分离方法。

本研究选用二核苷酸重复（CA）n为探针进行富集和杂交，是因为（CA）n或（GT）n在动物基因组中的含量最丰富，其次是（CT）n［16］，同时研究结果也发现， 微卫星类型主要由CA重复组成。本文选用的探针是（CA）12，主要考虑到探针中碱基对的增加会直接影响到杂交的效率，碱基对越多越不容易杂交，故本文选用（CA）12探针。为了提高微卫星的富集效率，EDWARDS等［17］提出用多种探针来筛选文库被广泛应用，所出在今后的研究中可出用多种探针混合起来进行杂交分离微卫星片段，是增加微卫星种类的理想选择。

微卫星核心序列突变率相对较高，造成了微卫星核心序列重复次数的变化，这是微卫星多态性的基础，并且微卫星重复次数多少与多态性程度成正相关。然而，从后续的引物设计结果来看，如果重复次数过高导致侧翼序列很短而难出设计引物，从而导致这条序列也无法使用，所出重复次数过多过少都不好，本研究中所得到的序列重复次数范围为7～59，平均为38次，实验结果证明该重复次数范围较合适。

本研究构建曼氏无针乌贼微卫星富集文库及分析其序列组成，为进一步筛选大量的微卫星引物奠定基础，出期为保护曼氏无针乌贼野生群体、开展优质亲本选择、亲子鉴定、苗种繁育、增殖放流效果评估等提供理论依据。

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Construction and Identification of DNA Libraries Enriched for microsatellite Repeat Sequences of Sepiella maindroni

ZHANG Chuan1，2， GUO Bao-ying1，2， WU Chang-wen2
（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province， Key Lab of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province，Zhoushan 316021； 2. National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture， College of Marine Science and Technology， Zhoushan 316022， China）

Sepiella maindroni is one of four famouse marine product in China， it is very significant to develop the microsallite markers for research and utilization value. In this study， the microsatellite enriched-libraries of the S. maindroni was constructed according to the FIASCO （Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats）protocol. Finally， this experiment obtained 640 clones containing microsatellite sequence， of 640 （87%） positive clones， 103 sequences contained repetition that repeated no less than 7 times， according to Weber’s classification rules， these sequences were divided into three categories：perfect sequences （65% of total）， imperfect repeat sequences （22.3%）， and compound repeat sequences （12.7%）， the repeat time ranged from 7 to 59 with anaverageof 38. Of the 103 sequence， there are 42 sequences can be designed the primers and will be used to design primer and test polymorphism in further research. This study provides a base for molecular breeding and assessment of germplasm resources， genetic constructure， paternity test and evaluate the effect of enhancement and releasing of the S. maindroni.

Sepiella maindroni； microsatellite； magnetic bead enriched； DNA library construction

S917.4

A

1008-830X（2014）06-0483-05

2014-09-10

国家自然科学基金（31101937）; 港澳台科技合作专项（2014DFT30120）;浙江省自然科学基金(Y14C190008)； 舟山市科技局项目(2013C410 01); 浙江省海水增养殖重点实验室开放课题（2011-02）

张川（1989-） ,男， 湖北黄冈人， 研究方向：分子遗传学与系统进化. E-mail: zhang8103668@163.com

郭宝英， 女， 副教授. E-mail: guobaoying@zjou.edu.cn