咪达唑仑对山羊不同脑区Glu和Asp含量的影响

王冠颖，姜仁礼，李欣然，高 利

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030）

咪达唑仑，又称为咪唑安定，是一种短效的苯二氮卓类药物,有起效迅速、高效、低毒的特点，根据使用剂量不同发挥镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫及肌松作用。有研究表明，咪达唑仑与氯胺酮复合使用具有相加作用，可以有效降低肌肉紧张程度，增强对中枢神经系统的抑制作用[1]。咪达唑仑与隆朋和氯胺酮复合用于猫能产生确实的麻醉效果，但对猫的心脏功能抑制明显[2]。它作为复合麻醉剂的主要成分已被广泛研究并用于临床实践。但是，咪达唑仑对中枢的作用机制还不是很清楚。本试验通过使用咪达唑仑对山羊进行麻醉，监测不同脑区谷氨酸（glutamic acid，Glu）、天门冬氨酸（aspartic acid，Asp）含量的变化，以探讨咪达唑仑可能对中枢麻醉作用的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料 Waters600高效液相色谱系统；色谱柱Symmetry C18（4.6×150mm，5μm）；L-谷氨酸（LGlu）标准品：Sigma公司，批号：BCBB5881；天门冬氨酸（Asp）标准品：Sigma公司，批号：129K0181；2，4-二硝基氟苯：Sigma公司，批号D1529；色谱级甲醇；色谱级乙腈。

1.2 试验动物分组 八月龄健康山羊25只，雌雄兼用，体重13～15 kg，购自哈尔滨市香坊区某养殖场，按试验动物要求饲养管理，临床检查健康。随机分为对照组、诱导组、麻醉组、恢复I组和恢复II组共5个试验组，每组5只。

1.3 样品采集和处理 对照组肌肉注射生理盐水（1.31mL/kg）处死后立即取脑组织，试验组肌肉注射咪达唑仑（14mg/kg）后，根据山羊行为学变化分别于山羊倒地不起(诱导组)、翻正反射消失(麻醉组)、翻正反射恢复（恢复I组）和翻正反射恢复后6 h（恢复II组）处死立即取脑组织。在上述时间点对山羊进行处死并立即取脑组织，在冰面上分离大脑、海马、丘脑、小脑和脑干，取脑组织加入9倍体积的甲醇/水溶液（50∶50），手动匀浆数次后将匀浆液注入EP管中；离心30 min（4℃）3 000 r/min，取上清液-80℃保存。检测时取脑组织匀浆上清400μL，加入200μL乙腈，混匀，高速离心10min（4℃）15 000 r/min，取上清液加入0.5 mol/L NaHCO3溶液400μL，再加入0.5%的2，4-二硝基氟苯200μL，涡旋混匀，于65℃恒温水浴锅中衍生55 min，经0.22μm微孔滤膜过滤后，取20μL进样。

1.4 检测条件 色谱柱美国Waters公司生产Symmetry C18（4.6×150 mm，5μm）；流动相：A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲液（pH=6.6），B为乙腈/水（V/V=50∶50），进行梯度洗脱，流动相B的浓度由初始时65%经10 min至10%，18 min至40%；流速：0.6 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：28℃。取20μL进样分析，采用外标法定量。

1.5 数据分析 数据用平均值±标准差表示。使用SPSS 19数据分析系统做单因素方差分析，P＜0.05为差异显著，P≥0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 咪达唑仑麻醉后山羊不同脑区神经递质Glu的含量 如表1所示：大脑Glu含量在恢复I组下降14%，与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。海马和小脑Glu含量在麻醉期下降至最低，分别下降6%和7%，与对照组比较差异显著（P＜0.05）。脑干Glu含量在诱导组和麻醉组下降14%和20%，与对照组比较差异极显著（P＜0.01），在恢复I组虽略有回升，但与麻醉组比较无显著差异（P＞0.05），与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。丘脑Glu含量在麻醉期下降5%，但无统计学意义（P＞0.05）。各脑区Glu含量在恢复II期均恢复到正常水平。

2.2 咪达唑仑麻醉后山羊不同脑区神经递质Asp的含量 如表2所示：咪达唑仑麻醉对山羊不同脑区Asp含量的影响呈现两种不同的趋势。大脑、小脑和脑干Asp含量在麻醉期达最大值，分别升高34%（P＜0.05）、29%（P＜0.05）和40%（P＜0.01）；并在恢复I组下降，小脑和脑干与麻醉组相比差异显著（P＜0.01或P＜0.05）；在恢复II组显著恢复至正常水平（P＜0.05），与麻醉期比较差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。而海马与丘脑Asp含量则在麻醉期显著下降，分别下降22%（P＜0.01）和16%（P＜0.05）；恢复I组丘脑Asp含量依然低于正常水平（P＜0.05）；至恢复II期两脑区Asp含量均显著恢复（P＜0.05），且与麻醉期比较差异显著（P＜0.05）。

表1 咪达唑仑麻醉后山羊不同脑区G lu的含量

3 讨论

谷氨酸（Glu）是动物体内的一种非必需氨基酸，在化学突触中被储存在囊泡中。神经冲动触发突触前膜释放谷氨酸，到达突触后膜后，激活谷氨酸受体，产生兴奋性突触后电位。Glu的作用不仅是在突触内点对点传递兴奋，它也可以溢出突触，在突触之间与邻近的突触进行突触外信号传输[3]。此外，谷氨酸也可作为GABA能神经元合成抑制性神经递质GABA的前体，反应由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化。NMDA受体是最重要的谷氨酸受体，许多研究表明，氯胺酮的麻醉和致幻效果与其非竞争拮抗谷氨酸NMDA受体有关[4]。目前全麻药与Glu及NMDA受体的关系大多局限于静脉麻醉药和吸入麻醉药的中枢机制[5-6]，有关咪达唑仑的研究较少。赵秋华等[7]研究证明，咪达唑仑可增强氯胺酮的镇痛作用，腹腔注射咪达唑仑后，对大脑皮层的抑制作用加强，麻醉深度进一步加深，并引起大鼠脑大脑皮层谷氨酸含量的显著下降，与本试验的结果一致，在本试验大脑中Glu在恢复I期含量仍持续降低，可能与这种抑制作用有关。咪达唑仑麻醉使山羊大脑、海马、小脑和脑干Glu含量下降，提示咪达唑仑的麻醉作用可能与减少Glu的合成与释放，减少兴奋性突触的传递有关。

天门冬氨酸（Asp）为酸性氨基酸，是普遍存在于生物体内的非必需氨基酸。Asp是一种兴奋性神经递质，由突触前膜释放，作用于突触后膜Glu受体，但不如谷氨酸作用强烈[8]。Asp、Glu及NMDA受体与学习、记忆及多种急慢性脑损伤的发生、发展、预后、治疗效果等有着密切关系[9]。全麻药对神经递质Asp的影响报道较少。本试验中大脑、小脑和脑干Asp含量先升高后降低，而海马与丘脑Asp含量则先下降后上升至正常水平，说明咪达唑仑对不同脑区的Asp作用不同，对大脑、小脑和脑干的作用是先产生兴奋作用接着转为抑制，这表明，对于Asp来说，山羊的大脑、小脑和脑干不是咪达唑仑麻醉时作用的靶位脑区，而海马与丘脑可能为咪达唑仑麻醉时作用的主要脑区。

4 结论

咪达唑仑使海马和丘脑Glu和Asp含量降低，因此海马和丘脑可能是咪达唑仑与兴奋性神经递质作用的靶位之一，在咪达唑仑全麻作用中发挥重要作用。

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