猪链球菌的分型鉴定及其体外形成生物被膜的研究

周永辉，王淑杰，黄全勇，陈俭清，李艳华

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨150001）

猪链球菌（Streptococcussuis，S.suis）已成为我国当前引起人兽共患病的一种重要的病原菌，可引起人畜的急性、热性传染病，会使人出现脑膜炎、关节炎、持久性听力缺失,严重者可导致中毒休克综合征并引起死亡。根据猪链球菌的荚膜多糖抗原可将其分为35个血清型，其中能引起人和动物发病的致病性猪链球菌血清型主要是1型、2型、7型和9型等。（Biofilm，B F）是细菌产生的多聚复合物基质将自身包绕，粘附于无活性物体或活体表面，形成的有一定结构的细菌群体；生物被膜内细菌容易对抗生素产生广泛的耐药性，造成感染难以治愈，反复发作[1]。国内学者证明，猪链球菌在体外可以形成生物被膜[2-3]。本试验对13株从病料中分离出的猪链球菌进行分型鉴定，并对其生物被膜能力进行测定及形态观察，为研究其致病性及生物被膜研究提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 菌株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。THB培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。试剂：pH值7.4磷酸盐缓冲溶液、结晶紫、甲醇、冰乙酸、犊牛血清、Taq DNA聚合酶（购自TaKaRa公司）；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。材料：卡尔加里生物膜装置、96孔细胞培养板。检测仪器：酶标仪（SN239591，美国Epoch）、扫描电镜（S-3400N，日本）、PCR仪（S1000TMThermal Cycler，美国）。

1.2 试验菌株培养及表型特征观察 首先将猪链球菌菌株于无菌条件下在THB琼脂平板上传代II代进行纯化分离，然后从THB琼脂平板上挑取单个菌落，接种于无菌THB液体试管中，37℃恒温培养箱中培养16 h后，取适量菌液稀释进行革兰染色，显微镜下观察。

1.3 生化试验 纯培养后的细菌进行甘露醇、山梨醇、菊糖、棉子糖和蜜二糖发酵试验，马尿酸盐试验，精氨酸和透明质酸酶水解试验，6.2%NaCl生长试验等。结果参照文献[4]的介绍进行判定。

1.4 猪链球菌的PCR鉴定及分型 猪链球菌鉴定引物及血清1型2型7型和9型猪链球菌的分型引物由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用常规方法对细菌DNA进行小量制备。常规PCR反应，之后用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.5 生物被膜的培养及形成能力测定 按照1.2方法培养细菌2代，比浊法将菌液浓度先调整为0.5麦氏管悬液（1.0×108CFU/mL），再用THB液体培养基稀释，使菌液浓度为1×106CFU/mL。每孔200μL菌液加到卡尔加里装置底部板内，只含THB液体培养基的孔为阴性对照组，边孔加生理盐水为空白对照，37℃，45 r/min摇床上培养。参照Stepanovic[5]的方法测定生物被膜的形成能力。PBS清洗3次，固定，染色，测OD595值。

1.6 S.suis生物被膜的形态学观察 首先从卡尔加里生物被膜装置上取下形成生物被膜的桩钉，并使用灭菌PBS洗涤3次以去除游离菌，用戊二醛固定，脱水处理，用冷冻干燥仪对样品进行干燥4 h。样品表面在真空条件下镀一层厚100A的金属膜，SEM下观察。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对相关数据进行统计分析，结果用均值±标准差表示，统计资料的比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 S.suis菌落及染色结果 细菌在未加犊牛血清的THB培养基平板上菌落为微小且透明，在加入血清的THB培养及平板上呈中等大小、光滑圆润不透明。在显微镜下可看到细菌呈蓝紫色长链状。

2.2 生化试验 13株菌株在菊糖、棉子糖和蜜二糖试验中呈阳性，甘露醇和山梨醇中为阴性，马尿酸盐中为阳性，精氨酸中为阳性，透明质酸酶试验为阴性，在6.2%NaCl中不生长，以上生化结果符合猪链球菌生化指标。

图1 猪链球菌显微镜下形态 （1 000×）

2.3 猪链球菌PCR鉴定及分型结果 13株菌扩增均得到689 bp的gdh目的基因（图2A）。其中1型引物扩增出约441 bp的片段，1号菌为1型猪链球菌（图2B）；其中2型引物扩增出约675 bp的片段，11号、12号菌为2型猪链球菌（图2C）；其中7型引物扩增出约335 bp的片段，2号、10号菌为7型猪链球菌（图2D）；其中9型引物扩增出约388 bp的片段，3、5、6、7号菌为9型猪链球菌（图2E）。

图2（A-E）猪链球菌PCR扩增结果

2.4 生物被膜的培养及形成能力测定结果 参照Stepanovic[5]的标准，13株猪链球菌均可形成生物被膜，1号、2号、3号、4号、7号、9号、10号、12号、13号菌OD595数值介于阴性对照组OD595（0.203±0.016）值的1倍到2倍之间，差异显著（P＜0.05），形成生物被膜能力较弱[5]；5号、6号、8号、11号菌OD595数值大于2倍阴性对照组OD595数值，但小于4倍阴性对照组OD595数值（0.203±0.016），差异显著（P＜0.01），形成生物被膜能力中等[5]。

图3 猪链球菌形成生物被膜测定结果（n=16，±SD）

2.5 S.suis生物被膜的形态学观察 通过扫描电镜观察了生物被膜的形态学，结果见图4。细菌镶嵌于生物被膜中，细菌周围有厚厚的黏液层。这些外观形态表明细菌形成了生物被膜，且形成生物被膜可从外观观察到有的形成生物被膜致密，有的则稀疏。

图4 S.suis生物被膜作用的形态学观察 （5μm）

3 讨论

猪链球菌病作为集约化猪群的主要传染病之一,受到越来越多养猪业者的重视[6]。猪链球菌按照荚膜抗原的差异可分为35个血清型（1～34，1/2）[7]。其中1型、2型、7型、9型是主要流行的致病血清型。

据报道猪链球菌的gdh基因具有保守性[8-9]，因此此次设计引物特异性的鉴定出猪链球菌，本试验对分离到的13株猪链球菌进行了致病性血清型鉴定，并成功鉴定出了1型1株，2型2株，7型2株，9型4株，为后续研究其毒力因子及其他特性做基础。对13株猪链球菌进行生物被膜培养，结果13株全部能形成生物被膜，根据猪链球菌生物被膜的形成能力判定标准[10]：临界值（OD c）约为阴性对照。当OD≤OD c时，判定细菌无生物被膜形成能力；当OD c＜OD≤2×OD c时，判定细菌生物被膜形成能力较弱；当2×OD c＜OD≤4×OD c时，判定细菌生物被膜形成能力中等；当4×OD c＜OD值时，判定细菌生物被膜形成能力强。根据判定标准形成生物被膜能力1号、2号、3号、4号、7号、9号、10号、12号、13号菌较弱，5号、6号、8号、11号菌中等，这些结果可能与菌体自身毒力基因及QS系统的调节有关[11]。生物被膜危害巨大，可造成细菌强力耐药性并且造成交叉感染，难于治理，所以亟待对其更深一步研究，找出对策对其进行清除治理。

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