葛根提取物对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的影响

何霞，季欧，李晋奇

·药理毒理·

葛根提取物对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的影响

何霞1，季欧2，李晋奇1

目的：观察葛根提取物对阿尔茨海默病大鼠的学习记忆能力的影响。方法：Morris水迷宫筛选学习记忆正常SD大鼠72只，随机分为假手术组12只，手术组60只，在脑定位仪定位下，手术组大鼠微量注射凝聚态β淀粉样蛋白25-35（beta-amyloid peptide 25-35）至海马内侧脑室以建立阿尔茨海默病(AD)模型；假手术组注射等量生理盐水。Morris水迷宫筛选模型成功大鼠，随机分为模型组、0.42mg．kg-1多奈哌齐治疗组、0.47g．kg-1、0.24g．kg-1、0.12g．kg-1葛根提取物治疗组和假手术组，每组10只SD大鼠。治疗组灌胃给药，每日一次，连续四周；Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力。结果：(1)与假手术组比较，手术组大鼠学习记忆能力明显降低（P＜0.01)。(2)与模型组相比，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组均可使大鼠的逃避潜伏期变短（P＜0.05，P＜0.01)，可使大鼠跨越平台次数及在平台象限游程百分比均增加（P＜0.05)。(3)各剂量组之间比较，于定位航行的第四、五天，大鼠逃避潜伏期差异明显（P＜0.05)。结论：1.大鼠侧脑室内注射Aβ25-35成功制备了大鼠AD模型。2.葛根提取物可改善AD大鼠的学习记忆能力，是否具有剂量依赖性，还需进一步研究。

阿尔茨海默病；葛根提取物；学习记忆能力；SD大鼠

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种以进行性记忆减退、认知功能障碍及精神异常为临床表现的中枢神经系统退行性疾病。典型病理特征为海马和大脑皮层内神经胞外淀粉样β蛋白（β-amyloid, Aβ）沉积，形成老年斑（senile plaque, SP），T au蛋白异常聚集形成的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）,以及脑皮层和海马区神经细胞减少。目前，65岁以上老人AD患病率随年龄增加而增长，2005年我国流行病学显示，65岁以上老年人的痴呆患病率为7.8%，其中AD患病率为4.8%，且随年龄增长而增加[1]。现AD已成为危害老年人的重要疾病之一，AD治疗药物的研究越来越多。

葛根（Radix Puerariae）为豆科植物野葛 Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根。其性凉，味甘、辛。具有解表退热，生津，升阳止泻等功效。用于外感发热头痛、高血压颈项强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻等。《本草纲目》载：葛根，性凉、气平、味甘，具清热、降火、排毒诸功效。现代医学研究表明，葛根中的异黄酮类化合物葛根素对高血压、高血脂、高血糖和心脑血管疾病有一定疗效。本实验通过乙醇回流提取，得到葛根提取物，以研究其对AD大鼠学习记忆的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性6月龄SD（Sprage-Dawley）大鼠，体重180～220 g，购于四川省人民医院实验动物研究所。

1.1.2 主要实验仪器 ELGA超纯水系统(英国ELGA公司)；DNP-9052型电热恒温箱(上海精宏实验设备有限公司)；ZH-蓝星C型脑定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；ZH-RXZ型柔性颅骨钻(淮北正华生物仪器设备有限公司)；微量进样器(上海高鸽工贸有限公司，平头，10毫升)；Morris水迷宫系统(成都泰盟科技有限公司)；MT-2000Morris水迷宫跟踪分析系统（S7200）。

1.1.3 主要实验药物和试剂 葛根提取物（Puerarin extraction）：1g相当于原生药31.98 g，四川省人民医院药学部药研室制备；盐酸多奈哌齐（Donepezil Hydrochloride）：5 mg/片，批号：091129A，国药准字H20050978，卫才（中国）药业有限公司；Aβ25-35：北京博奥森生物技术有限公司；戊巴比妥钠：沃凯国药集团化学试剂有限公司；苦味酸：台山市众诚化工有限公司，批号：20101101。

1.2 实验方法

1.2.1 药物配制 葛根提取物临用时以温开水分别配成浓度为4.7%、2.4%、1.2%的混悬液；盐酸多奈哌齐临用时以温开水配成浓度为0.004%的混悬液，置于冰箱4℃保存备用。

1.2.2 给药剂量的确定 盐酸多奈哌齐成人剂量为5 mg．d-1。根据人和动物体表面积计算方法[2]，将盐酸多奈哌齐转换为大鼠等效剂量0.42 mg．kg-1．d-1。葛根提取物剂量根据最低中毒剂量换算，预计分为高、中、低三组，分别为0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1。

1.2.3 给药 用药组分别按葛根提取物和盐酸多奈哌齐灌胃给药，模型组和假手术组灌胃给予等容量生理盐水，每天一次连续给药4周，各组大鼠在用药期间自由饮水、进食。

1.2.4 Aβ25-35孵育 实验前一周以生理盐水将白色干粉Aβ25-35溶解为2μg/μl溶液，并置于37℃温箱中孵育一周，使其变为具有神经毒性的凝聚状态的Aβ25-35。

1.2.5 AD模型制备方法 大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射(30mg．kg-1)麻醉后，固定于脑立体定位仪上，俯卧位，头部备皮，以碘伏消毒手术区皮肤后，沿颅部正中矢状线划开头皮和骨膜，在用小棉球蘸取双氧水轻轻涂擦骨面，充分暴露前囟位置。参照《大鼠脑立体定位图谱》，选择右侧脑区(前囟向后1.0 mm，中线右旁2.0 mm，硬脑膜下4.0 mm)为注射靶区。用骨钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，垂直进微量进样针4.0 mm，将10 μg(2 μg/1 μg)聚集态的Aβ25-35溶液在5 min内缓慢注入，并留针10 min使溶液充分弥散,拔针5 min。缝合切口，于缝合处用0.1 mL庆大霉素注射液处理。保暖至清醒后，放回笼中常规饲养。假手术组以等量无菌生理盐水代替Aβ25-35溶液，其余操作同上。所有操作均在相对无菌条件下进行。

1.2.6 Morris水迷宫测试 定位航行实验（Place navigation test, PNT）:用于检测动物在水迷宫的学习能力[3]。于大鼠最后一次灌胃给药后一小时开始。每只大鼠用苦味酸在背部标记。每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次，每次分别从3个不同的标记点将大鼠面向池壁放入水中，记录120 s内寻找平台所需时间（逃避潜伏期），每次至少间隔30 min，共训练5天，平台位置均保持不变。先将平台置于东南象限中间，大鼠置于平台上，20 s后从离平台最远的象限面向池壁将大鼠放入水中，记录并观察大鼠寻找平台的路线和逃避潜伏期等。如果大鼠在120 s内未找到平台，将其重新置于平台20 s，后移出。

空间探索实验（Spatial probe test, SPT）:用于检测动物在水迷宫的空间记忆能力[3]。于第六天进行空间探索实验。将平台撤离，任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠在120 s内跨过虚拟平台的次数及在平台象限游泳距离占总游程的百分比。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 AD模型建立判断

水迷宫实验的定位航行实验中，各组大鼠逃避潜伏期随着游泳天数的增加而下降，说明大鼠在五天的游泳训练中寻找平台有一定的学习记忆能力。在定位航行训练的第五天，空白组大鼠逃避潜伏期为A（11.34±4.13）秒，手术组大鼠逃避潜伏期为B（50.64±2.42）秒，（B-A）/B%为74.66%，根据痴呆模型的判断标准：（B-A）/B%＞20%，提示：大鼠双侧脑室注射小剂量Aβ25-35混悬液成功制备大鼠AD模型。

2.2 水迷宫检测葛根提取物对大鼠学习能力的影响

2.2.1 定位航行实验 从表1和图1可见，各组大鼠逃避潜伏期随着游泳天数的增加而不断下降，说明各组大鼠定位航行的游泳训练中对于平台均有一定的学习记忆能力，但其学习记忆能力存在很大差异。第一、二天各组的潜伏期相比无统计学意义，从第三天到第五天，与假手术组相比，模型组大鼠逃避潜伏期显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组均可使大鼠的逃避潜伏期变短（P＜0.05，P＜0.01）；第四天，0.47 g．kg-1．d-1葛根提取物组与0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组之间差异明显（P＜0.05），第五天，0.47 g．kg-1．d-1和0.24 g．kg-1．d-1葛根提取物组与0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组有差异（P＜0.05）。

表1 葛根提取物对大鼠逃避潜伏期的影响（，n=10）

表1 葛根提取物对大鼠逃避潜伏期的影响（，n=10）

与假手术组比较▲P ＜0.01；与模型组比较**P ＜0.01，*P ＜0.05；与0.12g．kg-1葛根总皂苷治疗组比较♥P＜0.05▲P ＜0.01υs sham operation group；**P ＜0.01，*P ＜0.05υs model group；♥P＜0.05υs 0.12g．kg-1Puerarin extracttreatment group

逃避潜伏期(S)第一天 第二天 第三天 第四天 第五天假手术组 — 111.28±3.92 92.94±2.49 44.92±1.54 20.59±2.64 10.18±2.48模型组 — 115.24±5.69 98.08±1.88 64.33±2.85▲61.49±3.53▲50.94±2.42▲多奈哌齐 0.42mg．kg-1112.53±2.94 95.57±1.76 54.40±2.28*35.16±1.86**20.33±3.28**葛根总皂苷 0.12g．kg-1114.23±6.11 96.49±2.38 56.41±3.24*43.82±2.15**32.52±2.83**葛根总皂苷 0.24g．kg-1113.86±2.98 95.93±2.06 54.79±4.13*40.39±3.32**28.85±3.20**♥葛根总皂苷 0.47g．kg-1111.81±3.14 94.39±2.62 50.60±2.61**34.30±2.46**♥19.53±3.20**♥组别 剂量

图1 葛根提取物对大鼠逃避潜伏期的影响

2.2.2 空间探索实验 从表2可见，与假手术组相比，模型组跨越平台次数及在平台象限游程百分比显著下降（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组相比，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组均可使大鼠跨越平台次数及在平台象限游程百分比均增加（P＜0.05）;葛根提取物三剂量组之间比较，大鼠跨越平台次数和在平台象限游程百分比差异较小，无统计学意义。

表2 葛根提取物对大鼠跨域平台次数及平台象限游程百分比的影响(，n=10)

表2 葛根提取物对大鼠跨域平台次数及平台象限游程百分比的影响(，n=10)

注：与假手术组比较▲P ＜0.01；与模型组比较*P ＜0.05▲P ＜0.01υs sham operation group；**P ＜0.01，*P ＜0.05υs model group

组别 剂量 跨越平台次数 平台象限游程百分比(次数／120S) （%）假手术组 —— 11.20±2.86 30.85±2.33模型组 —— 2.50±1.02▲16.04±1.65▲多奈哌齐组 0.42mg．kg-18.00±2.05*25.85±1.40**葛根提取物 0.47g．kg-18.80±1.25**23.42±2.12*葛根提取物 0.24g．kg-16.50±1.50**17.73±1.81葛根提取物 0.12g．kg-15.80±2.13 20.33±1.73

3 讨论

3.1 AD模型建立及其可靠性

3.1.1 模型动物的选择 近年来，随着人口的老龄化，阿尔茨海默病越来越成为威胁人类的一种严重疾病，对于探讨AD的发病机制及开放筛选有效防治AD疾病的药物也越来越引起国内外学者的关注。人类疾病的研究，可通过动物模型的建立，来进行相关研究。目前动物模型采用的实验动物有小鼠、大鼠、家兔和狗等。

本实验选用的雄性SD大鼠，其具有多个优点。首先，大鼠在神经解剖方面与人类极为相似[5]，其脑血管解剖及海马的结构与人类的结构有较高的相似度。其次，由于雌激素[6]可增强胆碱神经生长因子的敏感性，增强胆碱神经元的功能，改善AD患者的认知功能。为了更好地模拟AD的病理改变，减少性别差异对实验结果的影响，本实验选用雄性大鼠。最后，大鼠的生长繁殖能力较强，饲养管理方便，成本较低，能大批量应用统计，且大鼠生理、生化、药理等方面的实验已经资料较为丰富。因次，本实验选用雄性SD大鼠做为模型动物。

3.1.2 AD模型评价 阿尔茨海默病的发病机制目前尚未完全明确，现有多种学说和假说，如遗传学说、胆碱能假说、铅中毒假说、淀粉样蛋白级联反应假说和Aβ沉积学说等。根据这些学说，模拟AD的动物模型方法大致分为损害模型、自然衰老模型、转基因动物模型和Aβ动物模型。

实验采用A β动物模型。阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）最主要的病理特征之一是老年斑（SP）形成。β-淀粉样蛋白是SP的核心成份。AD病人脑中SP的数量与痴呆的严重程度呈正相关。Aβ是由淀粉样前体蛋(amyloid precursor protein，APP)分解而来的～种含39.43个氨基酸残基的疏水肽，它包括多种活性片段，如Aβ25-35，Aβ1-40和Aβ1-42。脑内急性注射Aβ可使动物产生与AD相似的行为障碍和记忆缺损症状，并出现Aβ沉积。在AD中，Aβ的沉积存在一个恶性循环，即中枢胆碱能耗竭增加Aβ的产生和神经毒性，而Aβ又进一步削弱胆碱能神经传递的效应。凝聚状态与可溶性的单体物质相比，前者对神经元的毒性更大[7]。故采用孵育一周后凝聚态Aβ25-35作为注射。

3.2 葛根提取物对AD大鼠学习记忆能力的改善

目前，测试学习记忆能力的方法主要有：Y-迷宫实验、放射状迷宫实验、跳台实验、穿梭实验、高架迷宫实验、旷场实验和Morris水迷宫实验等。Morris水迷宫实验是由Richard Morris在1984年设计用来测试实验动物学习和记忆能力的一种模型[8]。它通过记录动物入水后搜索水下平台的时间和游泳游程，用于分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力，它能较准确反映动物的空间学习和记忆能力，可作为测试实验动物学习记忆水平的重要工具。

Morris水迷宫实验包括定位航行实验和空间探索实验。（1）定位航行实验：通过反复训练，大鼠能够利用周围环境的空间线索对水下的平台进行定位，以测定大鼠的学习能力，这种能力采用入水至爬上平台的游泳路程，即逃避潜伏游程来表示。本研究结果发现：从第三天开始，与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著增加，与模型组相比，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组均可使大鼠的逃避潜伏期变短，说明模型组在实验期间学习能力有所下降，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组学习能力均明显改善。第五天，0.47 g．kg-1．d-1和0.24 g．kg-1．d-1葛根提取物组与0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组有差异，但差异具有依赖性。逃避潜伏游程变化趋势看，假手术组来越短，符合学习越来越快特点，模型组逃避潜伏游程上下波动，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组变化趋势不如假手术组，但是优于模型组，推测可能是注射Aβ25-35造成海马损伤，导致学习过程不稳定，而多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组相对于模型组有所改善。（2）空间探索实验：撤掉平台，大鼠根据记忆对平台的反复寻找，以测定大鼠的记忆能力。利用大鼠跨越平台的次数和在原平台象限游泳路程的百分比例来表示大鼠的记忆能力。实验结果表明：与假手术组相比，模型组跨越平台次数及在平台象限游程百分比显著下降，说明模型组的实验期间记忆能力有所下降；与模型组相比，多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组均可使大鼠跨越平台次数及在平台象限游程百分比均增加，说明多奈哌齐组、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物组在实验期间记忆能力得到一定改善。

4 结论

4.1 大鼠侧脑室内注射Aβ25-35成功制备了大鼠AD模型。

4.2 葛根提取物可改善AD大鼠的学习记忆能力，是否具有剂量依赖性，还需进一步研究。

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[8] Charles V Vorhees,Michael T Williams.Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].NATURE PROTOCOLS,2006;1(2)848.

（责任编辑：蒋淼）

The pharmacological effect of Puerarin extract on learning and memory ability of rats with Alzheimer disease

HE Xia1, JI Ou2, LI Jin-qi1// (1.Department of Pharmacy, Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan; 2 .Sichuan Orthopaedic Hospital, Chengdu 610041, Sichuan)

Objective:To investigate the effects of Puerarin extraction on the learning and memory ability in the rat model of Alzheime disease (AD). Method:72 normal SD rats were randomly divided into Sham-operated group (12 rats) and surgery group (60 rats) after being screened by Morris water maze method. 10 μg of beta-amyloid peptide 25-35（2 μg．μL-1）was injected into the lateral ventricle to establish AD rat model with stereotaxis instrument, and equivalent volume of saline was injected into sham operated group. Then the rats were randomly divided into sham operated group, AD model control group, 0.42 mg．kg-1Donepezil treated group, 0.47g．kg-1, 0.24g．kg-1, and 0.12g．kg-1Puerarin treated group (10 SD rats for each group). The rats of Donepezil treated group were intragastric administered with Donepezil daily, and 0.47g/kg, 0.24g/kg, and 0.12g/kg Puerarin treated group were intragastric administered with Puerarin extract once a day for 4 weeks. The Morris water maze was used to investigate the ability of learning and memory of rats. Result:(1) Compared with the sham-operated group, the learning and memory ability of the rats in operation groups were decreased signifcantly（P＜0.01). (2) Compared with the model group, 0.42 mg．kg-1Donepezil treated group, 0.4 7g．kg-1, 0.24 g．kg-1and 0.12 g．kg-1Puerarin extract treated group demonstrated shortened escape latency of rats（P＜0.05，P＜0.01), increased number of Crossing platform and run percentage of target quadrant（P＜0.05).(3)Compared among the Puerarin extract treated groups, there were signifcant differences in the escape latency of rats, in the fourth and ffth day of the navigation test(P＜0.05).Conclusion:(1) In this study, AD rat model is successfully established by injecting Aβ25-35 into lateral ventricle. (2) Puerarin extract can improve the learning and memory ability in the rat model of Alzheime disease, but urther study is still needed to explore the dose-dependent relationship.

R 285

A

1674-926X(2014)05-013-04

1. 四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072 2.四川省骨科医院, 四川 成都 610041

何霞，女，硕士研究生，主管药师，主要从事临床药理学和药物基因组学的研究Tel:02887393405 Email:66280253@qq.com

李晋奇，男，博士，副研究员，主要从事药理学研究 Tel:02887393316 Email:lijinqi2002@126.com

2014-03-03