赤雹根总皂苷对AA大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响*

杨会杰，阎 昊，佟继铭，刘永平

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

赤雹根总皂苷对AA大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响*

杨会杰，阎 昊，佟继铭，刘永平△

(河北省中药研究与开发重点实验室，承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

目的:观察赤雹根总皂苷(TSTDR)对佐剂性关节炎(AA)大鼠脾脏指数和脾脏肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)表达的影响。方法:雄性SD大鼠60只随机分为正常对照组，模型组，TSTDR低(40mg/kg/d)、中(80mg/kg/d)、高(160mg/kg/d)剂量组和雷公藤多苷组(12mg/kg/d)。大鼠右后足跖部皮下注射弗氏完全佐剂0.1ml建立AA大鼠模型，成模后各用药组大鼠分别灌胃给予相应药物21d。计算大鼠的脾脏指数，免疫组织化学染色法检测各组大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。结果:TSTDR中、高剂量组大鼠的脾脏指数显著低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。TSTDR各剂量组大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显低于模型组(P＜0.01，P＜0.05);并且，TSTDR中剂量组、TSTDR高剂量组大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显低于TSTDR低剂量组(P＜0.01，P＜0.05)。结论:抑制脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达可能是TSTDR治疗AA的机制之一。

赤雹根总皂苷;佐剂性关节炎;TNF-α;IL-1β;IL-6

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性进行性对称性关节炎为主的一种全身性自身免疫性疾病，可导致关节破坏、畸形和功能障碍。佐剂性关节炎(AA)是最常用于RA研究的动物模型，其组织病理变化和发病机制与人RA相似[1]。满药赤雹根是葫芦科植物赤雹(TDB)的干燥根，味苦、性寒，满族民间用于治疗跌打损伤、肌肉痛、腰腿痛、风湿痛等，疗效显著，且无明显毒副作用，具有重要的开发利用价值[2]。赤雹根总皂苷(TSTDR)是赤雹根主要的有效成分，前期研究显示TSTDR可明显降低AA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，对RA治疗效果显著[3-5]。本研究进一步观察了TSTDR对AA大鼠脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达的作用，以丰富TSTDR治疗RA的实验研究。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 弗氏完全佐剂(FCA)，美国Sigma公司，批号:100M8725;兔抗鼠TNF-α、IL-1β、IL-6一抗，美国Bioworld公司;免疫组化试剂盒，北京四正柏生物科技有限公司;雷公藤多苷片(TG)，安徽新陇海药业有限公司，批号:100301;TSTDR，承德医学院中药研究所药理毒理研究室制备。

1.2 实验动物分组与处理 8周龄雄性SD大鼠60只，体重180-200g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号:SCXK京2009-0007。大鼠随机分为正常对照组，模型组，TSTDR低、中、高剂量组和TG组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA 0.1ml，以注射点周围出现明显白泡为佳，以致炎后第18d大鼠AI值≥6为成模标准[6]。成模后各用药组大鼠分别灌胃给予相应药物，正常组和模型组灌胃给予等容积蒸馏水，各组大鼠连续给药21d。

1.3 检测脾脏指数 大鼠称重后处死，取脾脏称重，计算脾脏指数=[脾脏重量(mg)/大鼠体重(g)]×100[7]。

1.4 检测脾脏TNF-α、IL-1β和IL-6的表达 采用SP免疫组织化学染色法，一抗稀释浓度均为1:100，以PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素复染。10×20倍光镜下观察各个因子的表达情况，以细胞质中出现淡黄至褐黄色颗粒状着色者为阳性细胞。采用IPP 6.0软件测定脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6免疫组化染色的IOD值，取平均值进行半定量分析。

1.5 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脾脏指数 模型组大鼠的脾脏指数明显高于正常对照组(P＜0.01);TSTDR中、高剂量组大鼠的脾脏指数明显低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)。见附表。

附表 各组大鼠的脾脏指数和脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达(±s，n=10)

附表 各组大鼠的脾脏指数和脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达(±s，n=10)

与模型组比较:aP＜0.01，bP＜0.05;与TSTDR低剂量组比较:cP＜0.01，dP＜0.05

组别 剂量(mg/kg) 脾脏指数(g/100g) TNF-α(IOD值) IL-1β(IOD值) IL-6(IOD值)正常对照组 — 0.16±0.026a 0.09±0.02a 0.11±0.03a 0.17±0.05a模型组 — 0.21±0.041 1.52±0.28 1.61±0.34 1.48±0.31 TSTDR低剂量组 40 0.20±0.081 1.01±0.22b 0.98±0.29b 1.12±0.29 TSTDR中剂量组 80 0.18±0.015b 0.54±0.13ad 0.49±0.18ad 0.57±0.21bTSTDR高剂量组 160 0.16±0.021a 0.47±0.15ad 0.35±0.11ac 0.48±0.16adTG组 12 0.18±0.026 0.39±0.11ac 0.41±0.12ac 0.51±0.14ad

2.2 脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达 与正常对照组比较，模型组大鼠脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，TSTDR各剂量组大鼠脾TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显降低(P＜0.01，P＜0.05);并且，TSTDR中剂量组、TSTDR高剂量组大鼠脾TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显低于TSTDR低剂量组(P＜0.01，P＜0.05)。见附表。

3 讨论

目前，类风湿性关节炎(RA)的发病机制尚不清楚，近来的研究表明，细胞因子和各种炎症细胞组成了RA发病的复杂免疫网络，并且细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等在这一网络中起着关键性的作用[8]。

脾脏是最大的外周免疫器官，其相对重量的变化是反映机体免疫功能最基本和最常规的指标。脾中定居有各种炎症细胞，并释放细胞因子，其中IL-1β是重要的炎症因子，主要由单核/巨噬细胞分泌，能激活破骨细胞，加重滑膜的炎症反应[9]。IL-1β是使RA炎症反应应答放大并转化为破坏反应的重要细胞因子;TNF-α是强有力的促炎症细胞因子，可介导IL-1β的生成，并且具有类似IL-1β的致炎作用;IL-6可介导产生TNF-α、IL-1β及促进类风湿因子的产生[10]。因此，可从抑制这三个炎症因子的表达及阻断它们的作用途径探寻治疗RA的新方法。

本研究发现，TSTDR可明显降低AA模型大鼠的脾脏指数和脾脏TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平，表明TSTDR可通过降低脾脏指数和炎症因子的水平发挥免疫调节作用。其中高、中剂量TSTDR对脾脏IL-1β、TNF-α和IL-6表达的抑制作用更为突出，提示TSTDR可能具有直接抑制IL-1β和TNF-α表达的作用，也可能是因为TSTDR通过抑制IL-6的表达起作用，进而抑制RA病程的进展。本研究提示TSTDR可作为良好的抗RA药物深入研究，从而为临床治疗RA提供新思路。

[1]徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].第2版.北京:人民卫生出版社，1991.70.

[2]宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药大辞典[M].上册.北京:人民卫生出版社，2001.102.

[3]陈建双，于海荣，张玉玲，等.赤雹根总皂苷对类风湿性关节炎大鼠血清细胞因子的影响[J].时珍国医国药，2012，23(5):1097-1098.

[4]于晓敏，刘玉玲，刘永平，等.满药赤雹根总皂苷抗炎作用实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(10):227-229.

[5]刘永平，陈建双，赵波，等.赤雹根总皂苷对实验性佐剂型关节炎镇痛作用的研究[J].辽宁中医杂志，2011，38(8): 1659-1661.

[6]王学勇，张元，许建阳，等.金铁锁总皂苷抗类风湿性关节炎作用及其作用机制研究[J].中国中药杂志，2006，31(5): 419-421.

[7]刘茜，刘向国，武松.肺气肿肺气虚证模型大鼠胸腺指数、脾脏指数变化的实验研究[J].甘肃中医学院学报，2006，23(1):20-22.

[8]Bao L, Zhu Y, Elhassan AM, et al. Adjuvant-induced arthritis: IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha are up- regulated in the spinal cord [J]. Neuroreport, 2001, 12(18): 3905-3908.

[9]郑召岭，商玮，赵智明，等.姜黄素对佐剂性关节炎大鼠免疫器官质量的影响[J].中国中医急症，2009，18(2):264-265.

[10]Odeh M. New insights into the pathogenesis and treatment of rheumatoid arthritis [J]. Clin Immunol Immunopathol, 1997, 83(2): 103-116.

EFFECTS OF TSTDR ON TNF-α, IL-1β AND IL-6 EXPRESSION IN SPLEEN OF AA RATS

YANG Hui-jie, YAN Hao, TONG Ji-ming, et al (Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the effects of total saponins of Thladiantha dubia root (TSTDR) on spleen index and TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of adjuvant arthritis (AA) rats.Methods:60 male SD rats were randomly divided into the following 6 groups with 10 rats in each group: normal control group, model group, TSTDR low dose (40 mg/kg/d) group, TSTDR middle dose (80 mg/kg/d) group, TSTDR high dose (160mg/kg/d) group and tripterygium glycoside group (12mg/kg/ d). The AA rats’ model was established by injecting Freund’s complete adjuvant into the plantar subcutaneous layer of right rear foot of rats, and then the rats in each drug group were lavaged with corresponding drugs for 21 days. The spleen index of rats in each group was calculated and immunohistochemical method was used to detect the TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen.Results:The spleen index of rats in TSTDR middle and high dose group were obviously lower than that of rats in model group (P＜0.01, P＜0.05). The TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of rats in each TSTDR group were all significantly lower than model group (P＜0.01, P＜0.05); Moreover, The TNF-α, IL-1β, IL-6 expression in spleen of rats in TSTDR middle and high dose group were significantly lower than TSTDR low dose group (P＜0.01, P＜0.05).Conclusions: Inhibition of TNF-α, IL-1β and IL-6 expression in spleen may be one of the mechanisms of TSTDR for treating AA.

Total saponins of Thladiantha dubia root (TSTDR); Adjuvant arthritis; TNF-α; IL-1β; IL-6

R963

A

1004-6879(2014)01-0008-03

2013-07-18)

* 河北省自然科学基金项目(C200800655)，河北省教育厅重大项目(ZD2010131)

△ 通讯作者