益气解毒方上调miR-34a抑制鼻咽癌细胞生长增殖研究

黄远见，肖 娟，罗志强

(南华大学附属第二医院 耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001)



益气解毒方上调miR-34a抑制鼻咽癌细胞生长增殖研究

黄远见，肖 娟，罗志强*

(南华大学附属第二医院 耳鼻咽喉科，湖南 衡阳 421001)

目的：研究益气解毒方调控的miR-34a变化在抑制鼻咽癌细胞增殖中发挥的作用。方法：采用qRT-PCR法，分别检测鼻咽癌细胞株(益气解毒方处理组和DMSO对照组)中miR-34a的表达水平；采用MTT法研究益气解毒方调控的miR-34a抑制人鼻咽癌CNE2细胞生长增殖的能力。结果：MTT结果显示，与DMSO对照组细胞相比，益气解毒方处理组的CNE2细胞的增殖能力明显受到抑制，抑制效应呈剂量依赖关系。qRT-PCR结果发现，益气解毒方处理组中的miR-34a表达量较DMSO对照组显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论：益气解毒方可通过上调miR-34a表达而抑制鼻咽癌细胞增殖。

miR-34a；益气解毒方；鼻咽癌

中医药在肿瘤治疗方面有独特疗效，其因疗效确切、毒性低而受到国内外的广泛关注。中药复方及其有效成分可直接抑制或杀伤肿瘤细胞，是筛选抗癌药物的重要来源。“益气解毒方”是田道法教授在多年临床经验和研究的基础上研发的抗鼻咽癌制剂，其在动物实验和临床应用中都显示了良好效果，且该方经剂型改革，已经被药监部门批准，以“益气解毒颗粒”的剂型作为医院制剂，用于鼻咽癌的防治[1-4]。miRNA是目前肿瘤研究的热点，其参与了肿瘤的发生、发展和转移。为进一步研究益气解毒方对鼻咽癌的治疗效果，本文从miRNA入手探讨益气解毒方抑制鼻咽癌细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

CNE2为低分化鼻咽癌细胞株，由南华大学肿瘤研究所赞助。细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640，在95%湿度、5% CO2、37℃条件下贴壁生长。

1.2 益气解毒方制备

该方是临床上治疗鼻咽癌，特别是鼻咽癌复发和转移的经验方，具有益气解毒、生津润燥之功效，由黄芪、党参、天花粉、黄连、白花蛇舌草、茯苓、甘草等药物组成。上述药材用双蒸水浸泡4h，煮沸25min，过滤，50℃水浴中浓缩成1g/mL的药液，抽滤除菌供实验用。

1.3 定量PCR检测

采用SYBR方法，应用Biorad公司的定量PCR仪 IQ5进行定量PCR反应。通过公式2-△Ct计算miR-34a的相对表达量，其中 Ct=miR-34a平均Ct值-U6平均Ct值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 益气解毒方抑制人鼻咽癌CNE2细胞生长增殖

MTT结果显示，采用益气解毒方处理CNE2细胞24h、48h、72h后的OD值分别为 (0.37±0.03)、(0.44±0.04)、(0.51±0.05) ，对照组分别为(0.57±0.06)、(0.81±0.06)、(1.25±0.17)。处理48h、72h后，两组OD值差异显著，均具有统计学意义(P<0.05)，结果提示，益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞有抑制作用，且抑制效应呈显著的时间依赖关系。

2.2 益气解毒方上调miR-34a表达

笔者试从miRNA的角度探讨益气解毒方抑制鼻咽癌细胞的分子机制，前期结果显示miR-34a在鼻咽癌组织中表达下调，且能抑制鼻咽癌细胞的生长与侵袭。为了研究益气解毒方处理后的鼻咽癌CNE2细胞中miR-34a的表达情况，本文采用qRT-PCR法，分别检测了经过DMSO或益气解毒方处理后的鼻咽癌细胞中miR-34a的表达情况，结果发现，益气解毒方显著上调了miR-34a表达，与处理前比较升高(4.24±0.89)倍，与DMSO对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

研究显示，肿瘤相关的死亡中有70%以上是由癌细胞转移所致。因此，早期准确、无创地预测和监测肿瘤转移，可为患者制定个体化的预防和治疗方案提供重要依据，是提高肿瘤患者，特别是中晚期患者生存时间及生存质量的重要前提。寻找有效预防和治疗肿瘤转移的方法是临床面临的重大课题。鼻咽癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病具有明显的地区聚集性，广东省等华南地区尤为高发。世界卫生组织研究显示，40%的鼻咽癌发生在中国，严重威胁我国人民的生命健康。

miRNA是目前肿瘤研究的热点，其参与了肿瘤的发生、发展和转移。miR-34a在前列腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、胶质瘤以及乳腺癌等肿瘤组织和细胞中表达均下调。miR-34a过表达可抑制多种肿瘤的生长、侵袭与转移，在抑制肿瘤的发生发展中发挥重要作用[5-7]。以上研究均表明miR-34a是一种具有抑瘤功能的miRNA，本文前期研究也显示miR-34a在鼻咽癌组织中表达下调，且能抑制鼻咽癌细胞的生长与侵袭。

为证实益气解毒方是否通过上调miRNA抑制鼻咽癌的发生发展，笔者首先研究了益气解毒方对鼻咽癌CNE2细胞的影响。MTT结果显示，益气解毒方的抗肿瘤效应呈时间依赖性；后运用qRT-PCR法检测出益气解毒方能显著上调miR-34a表达。综上所述，益气解毒方可抑制鼻咽癌细胞增殖，通过上调miR-34a在鼻咽癌组织中的表达而发挥抗肿瘤效果。益气解毒方安全、可靠、低毒，结合其在miRNA通路中的调控作用，相信在不久的将来，其将在鼻咽癌的治疗中发挥广泛作用。

[1] 何迎春,卢芳国,田道法,等. 益气解毒方对DNP诱导TgN(p53mt-LMP 1)/HT小鼠鼻腔/鼻咽上皮癌前病变及p16和c-jun基因表达的影响[J].中国癌症杂志,2008, 18(10):734-738.

[2] 江洁琼,贺安意,田道法,等. 益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(42):552-555.

[3] 吴新正,戴娜,田道法,等. 益气解毒方对癌前病变鼻咽黏膜超微病理组织的逆转效应[J]. 湖南中医药大学学报,2012, 32(3):119-121.

[4] 胡梅,田道法,刘群良,等. 益气解毒方提取物对CNE2细胞的体内外抑瘤作用[J]. 中国中医药信息杂志,2012(11):115-118.

[5] YANG P, LI QJ, FENG Y, et al. TGF-β-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Cell, 2012,22(3):291-303.

[6] WU J, WU G, LV L, et al. MicroRNA-34a inhibits migration and invasion of gastric cancer cells via targeting to Fra-1 [J]. Carcinogenesis, 2012,33(3):519-528.

[7] LIU C, KELNAR K, LIU B, et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44 [J]. Nat Med, 2011,17(2):211-215.

(责任编辑：尹晨茹)

2013-12-27

黄远见(1975-)，男，南华大学附属第二医院主治医师，硕士研究生，研究方向为鼻咽癌的发病机制与防治。

罗志强(1964-)，女，南华大学附属第二医院主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为耳鼻喉临床。

R285.5;R739.6

A

1673-2197(2014)08-0035-02