鸭源沙门菌江苏分离株的生物学特性研究

许 明，龚建森，林 勇，韩先干，朱春红，周守长，俞 燕，庄林林，张 笛，窦新红，徐 步*

(1.中国农业科学院 家禽研究所，江苏 扬州 225125；2.江苏省农业科学院 畜牧研究所，江苏 南京 210014；3.中国农业科学院 上海兽医研究所，上海 200241；4.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009)

沙门菌(Salmonella)不仅能引起畜禽及其它动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食品导致人食物中毒，占细菌性食物中毒的42.6 %～60 %[1]。研究表明，沙门菌感染的禽群是通过食物链传给人的沙门菌最为常见的储存库之一，其原因是由于沙门菌在被感染的家禽中能通过水平传播和垂直传播引起广泛流行，而这与家禽饲养数量巨大关系密切[2]。研究显示，沙门氏菌众多毒力基因的存在是其致病的主要原因，而不同毒力基因组合可能赋予其不同的致病力[3]。沙门菌毒力相关基因分布在毒力岛、鞭毛、菌毛、噬菌体和质粒等。通过对沙门菌毒力基因的研究，为进一步研究细菌的致病性提供参考。生物被膜(Bacterial biofilms，BF)是单细胞生物体粘附在固体表面而聚集形成的一个群落，通过分泌多糖蛋白、纤维蛋白、脂质蛋白等物质将自身包裹其中。BF 已经被证明在许多细菌中存在，包括沙门菌、大肠杆菌、猪链球菌、嗜血杆菌和鸭疫里默氏杆菌等[4]。此外，BF 与细菌的耐药性相关，当细菌存在于BF 内对抗菌药物的抵抗能力显著增强[5]。本研究通过对江苏部分地区鸭源沙门菌的分离、血清学分型、毒力基因的检测、耐药性和BF 的研究，为鸭源沙门菌的致病机理研究及防控措施的制定提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 标准菌株及分离株 鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)ATCC14028、布雷得尼沙门菌(S.bredeney)CMCC50015、禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)CVCC44801 均由中国农业科学院家禽研究所保存提供；33 株鸭源沙门菌分离株为本实验室2012 年以来分离自江苏地区部分鸭场的发病或死亡鸭。

1.2 主要试剂 三糖铁琼脂、LB 琼脂、SC 肉汤、DHL 琼脂、MH 琼脂、沙门菌成套生化鉴定管均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；沙门菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA Marker、Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司。

1.3 鸭源沙门菌的鉴定与血清学分型 菌株的鉴定参考文献[6]的方法进行，挑取疑似菌株接种于LB琼脂，37 ℃过夜培养。参照文献[7]的沙门菌鉴定引物，提取分离菌株的基因组DNA，采用沙门菌通用鉴定引物(5'-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3'/5'-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3')，扩增其stn 基因片段，预期片段大小260 bp。PCR 反应体系为25 μL，PCR 反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃1 min、55 ℃1 min、72 ℃1 min，共25 个循环；72 ℃10 min。对PCR 鉴定阳性的菌株，用三糖铁琼脂培养鉴定，并做葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖发酵试验、吲哚试验、VP 试验、硫化氢试验、脲酶试验和动力试验等进一步进行鉴定。同时采用玻板凝集试验，通过沙门菌属诊断血清进行分离株的血清型鉴定。

1.4 鸭源沙门菌毒力相关基因的检测 参照文献[8]合成沙门菌17 种毒力基因的多重PCR 引物(引物序列信息如读者需要作者可以提供)，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR 反应体系为25 μL，反应条件为：95 ℃5 min；94 ℃30 s、66 ℃30 s、72 ℃2 min，共30 个循环；72 ℃10 min。以鼠伤寒沙门菌ATCC14028 和布雷得尼沙门菌CMCC50015为阳性对照，禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801 为阴性对照。

1.5 鸭源沙门菌药物敏感性检测 参照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)制定的抗菌药物敏感性试验执行标准，对15 种抗菌药的抗药性进行检测。即被检细菌培养于MH 琼脂平板上，将药敏纸片均匀贴于固体培养基表面，37 ℃培养过夜后，测量药敏片的抑菌圈直径。参照CLSI 标准，判定被检细菌对每种药物的敏感性，分别标记为敏感(Susceptible，S)、中介(Moderate，M)或耐药(Resistance，R)菌株。

1.6 鸭源沙门菌BF检测 参照文献[9]的方法，在无菌96 孔细胞培养板中加入OD600nm为0.1 的菌液100 μL，阴性对照孔加入等量的LB 液体培养基，37 ℃培养36 h；弃去培养液并用灭菌PBS 洗涤3次，自然风干；结晶紫染色30 min，PBS 洗涤；95%乙醇溶解后，酶标仪测定OD595nm。分离株的BF 形成能力被分为4 个等级[10]，OD 为被检细菌的OD595nm，ODc 为阴性对照的OD595nm，具体判定标准：OD

2 结果

2.1 鸭源沙门菌的鉴定与血清学分型 对疑似沙门菌分离株结合选择性培养基的鉴别结果，进行三糖铁试验与生化鉴定(靛基质、赖氨酸脱羧、尿素酶、氰化钾、山梨醇、甘露醇、水杨苷、丙二酸盐、卫矛醇、ONPG)，并采用沙门菌通用鉴定引物PCR 扩增stn 基因和沙门菌毒力基因的多重PCR 鉴定(图1)。结果显示，33 株分离菌均符合沙门菌特征。血清学检测结果显示，33 株沙门菌分离株分属于B、C2 和D1 3 个血清群的4 种不同血清型，其中48.5%的分离株为查理沙门菌(16 株)，39.4 %的分离株为印第安纳沙门菌(13 株)，9.1 %的分离株为肠炎沙门菌(3 株)，3.0%的分离株为鼠伤寒沙门菌(1 株)(图2)。

图1 沙门菌stn 基因及毒力基因的单一和多重PCR 鉴定Fig.1 Identification of Salmonella stn gene and virulence genes by single and multiple PCR

2.2 鸭源沙门菌的毒力相关基因的检测 鸭源沙门菌17 个毒力相关基因的检测结果表明，33 株分离株可以分为6 种毒力基因型，其中查理沙门菌含有3 种，印第安纳沙门菌含有2 种，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌均为同一种基因型(仅缺失cdtB 基因)。在33 株分离株中保守存在的基因有9 种，分别为pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、tolC、iroN、sopB及pefA；检测阳性率超过80 %的基因有4 个，分别为invA、orgA、sitC 及spiA 基因，检出率分别为97.0 %、90.9 %、90.9 %及84.8 %；lpfC、cdtB、spvB 及sifA 基因的检出率分别为60.6 %、39.4 %、12.1 %及12.1 %(表1)。

图2 33 株鸭源沙门菌分离株的血清型分布Fig.2 Serotype distributions of 33 Salmonella isolates from ducks

表1 17 种毒力基因在33 株鸭源沙门菌分离株中的分布情况Table 1 Distribution of 17 virulent genes in 33 Salmonella isolates from ducks

2.3 鸭源沙门菌的药物敏感性检测 对33 株鸭源沙门菌进行了15 种常见抗菌药物的敏感性检测。结果表明，耐药性达到50 %以上的有9 种药物，分别为氨苄西林、阿莫西林、链霉素、环丙沙星、诺氟沙星、甲氧氨嘧啶、复方新诺明、氯霉素和四环素，其中氨苄西林和甲氧氨嘧啶耐药率最高，分别为100 %和96.7 %。头孢类药物耐药率较低，分别为头孢他啶(21.2 %)、头孢噻肟(9.1 %)和头孢曲松(0)。在33 株分离菌中，同时耐药8 种以上的有14株(42.4 %)，耐药最多的菌株可同时耐受14 种药物，仅对一种药物敏感。有3 株细菌只耐其中的2～3 种药物，未发现不耐药的菌株(表2)。

2.4 鸭源沙门菌的BF检测 BF 检测结果表明，具有强BF 形成能力的分离株有3 株，中等的有11株，弱的有6 株，不形成BF 有13 株(图4)。其中具有中等或强BF 形成能力的14 株细菌中，耐药达到8 种以上有8 株(57.1 %)，在3 株BF 形成能力强的细菌中，有2 株耐药达到12 种以上。在这14 株中等或强BF 形成能力细菌中，有6 株均对氨苄西林、阿莫西林、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星、甲氧氨嘧啶、复方新诺明、氯霉素和四环素具有耐药性。

表2 33 株鸭源沙门菌分离株的药敏试验Table 2 Drug sensitivity assay for 33 Salmonella isolates from ducks

图3 33 株鸭源沙门菌分离株的BF 表型分析Fig.3 BF of 33 Salmonella isolates from ducks

3 讨论

本研究对2013 年以来，江苏部分地区临床分离的33 株鸭源沙门菌进行了血清学分型，结果表明其优势血清型为C2 群的查理沙门菌，其次为B 群的印第安纳沙门菌，而常见的几种鸭源沙门菌(如肠炎沙门菌与鼠伤寒沙门菌)在本研究中并不占据主导优势。沙门菌的流行血清型与宿主来源、分离时间和分离地点均存在一定相关性，因此需加强对临床流行菌株的监测[11]。本研究从病鸭中首次分离到查理沙门菌，该血清型是引起人类腹泻的重要血清型[12-13]，其公共卫生学意义值得关注。

对33 株鸭源沙门菌毒力基因检测结果表明，pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、tolC、iroN、sopB和pefA 为保守基因，其中prgH、tolC、sopB 和pefA与宿主识别和侵入有关，spaN 和sipB 与非吞噬细胞内化或杀伤巨噬细胞有关，iroN 为铁摄取基因，pagC 和msgA 与巨噬细胞内生存有关。该检测结果与国外报道基本一致[8]，但在pefA 基因的检出率存在较大差异，是否与本研究中的菌株均来自同一宿主有关，需进一步研究。根据对不同血清型菌株的比较显示，查理沙门菌和印第安纳沙门菌分别具有3 种和2 种基因型，而鼠伤寒和肠炎沙门菌仅有1种基因型，结果表明分离株来源越多，其基因型也越复杂[6]。而部分基因的分布也与血清型存在相关性，如spvB 和sifA 基因仅存在于鼠伤寒和肠炎沙门菌中，cdtB 基因仅存在于印第安纳沙门菌中，而lpfC 存在于印第安纳以外的几种血清型中。Ewers等研究显示血清型与毒力基因类型的关系可能与基因的水平转移相关，其相关性及具体机制仍需进一步的研究[14]。

本研究对33 株鸭源沙门菌进行了15 种药物的药物敏感试验，结果表明耐药性达到50 %以上的药物有9 种，耐药最多的菌株可同时耐受14 种药物，仅对一种药物敏感，表明目前临床沙门菌多重耐药性非常严重，而这与抗菌药的长期不合理使用有密切关系，应引起兽医工作者的高度重视[15]。而头孢类抗生素在本次研究中耐药性较低(小于21.2 %)，临床可以考虑作为治疗鸭沙门菌感染的侯选药物。

BF 是细菌防御抗菌药物的天然屏障，是造成细菌产生耐药性的重要因素之一。本研究通过结晶紫染色法对33 株细菌进行BF 的检测，结果表明，BF形成能力强的3 株分离株有2 株耐12 种以上的药物。14 株BF 形成能力中等以上的菌株中，耐药达到8 种以上的菌株占57.1%。本研究结果表明，鸭源沙门菌BF 的形成能力对细菌耐药性具有重要意义。

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