基于m tCOI片段序列的南极海域浮游动物DNA条形码研究

程方平 王敏晓 孙松 李超伦 张永山

0 引言

独特的地理位置及生态特征使得南极地区成为全球气候变化最为敏感的地区。在全球变暖的大趋势下，该区域的南极半岛20世纪50年代以来升温显著［1］。环流和海冰是影响南大洋生态系统结构最为重要的因素，小范围的温度变化会对海冰范围及其消融的周期产生重要影响，因此极地海洋生态系统对气候变化反应格外敏感，南大洋已成为研究全球变化的热点区域［2］。

浮游动物生活周期短，代谢活动强，活动能力较弱，对外界环境的变化极其敏感。而极地浮游动物的种群演替与海冰生息变化息息相关，对于环境扰动的响应更为强烈，因此常被用作研究全球气候变化对极地生态系统影响的重要指标［3］。根据物种组成，极地浮游动物可以划分为大洋群落，近岸群落和磷虾群落。浮游动物群落结构与洋流、海冰分布以及温盐等环境因素存在显著相关性［4-5］，因此浮游动物群落结构的长期变化观测对于研究理解全球气候变化对极地海洋生态系统的影响意义重大。而准确的种类鉴定是极地浮游动物群落结构变化的前提条件，个别近缘物种间的更替也会导致群落结构的变更［6］。

浮游动物涉及多个类群，准确的种类鉴定往往需要多名专家合作才能完成。基于形态的浮游动物分析专业技术性强，操作费时、费力，形态鉴定已成为及时获取浮游动物群落变化信息的瓶颈［7］。同种异名以及隐种的普遍存在增加了样品鉴定的难度［8］，而浮游动物的幼体鉴定更是困难重重［9］。

DNA条形码（DNA barcoding）通常是指使用线粒体细胞色素c氧化酶第一亚基编码基因片段序列（mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene，mtCOI）作为种类鉴定标签条码的技术［10］。该方法已被证明是中国近海浮游动物种类鉴定的有效手段［11-14］，北极海域的比较研究也证实了DNA条形码在极地浮游动物种类鉴定及相关研究中的可靠性［15］。除了栉水母外，DNA条形码适用于浮游动物其他主要类群，并成为浮游动物生态研究中的有力工具，被应用于海洋浮游动物物种快速鉴定、隐种发现、营养关系研究、生物入侵种监测、群落历史演变反演、种群遗传学以及生物地理学等多个领域［16］。南极海域已有基于DNA条形码浮游动物幼体研究的相关报道［9，17］，研究结果表明由于缺乏完备的数据库，相当部分的幼体无法得以准确鉴定［17］。虽然南极海洋生物普查（CAML）获取了大量海洋生物的DNA条形码，但绝大部分数据并未公开［8］，已有报道仅综述了项目的进展情况，缺少关于浮游动物DNA条形码的系统比较结果，严重制约了该技术在相关研究中的应用。

本研究利用2008年和2011年在南极普里兹湾和南极半岛周边海域采集的浮游动物样品，构建了南大洋中国南极科学考察调查海域浮游动物常见种的DNA条形码数据库。系统比较分析了该海域35种常见浮游动物124条mtCOI序列，验证南极海域DNA条形码浮游动物种类鉴定的有效性；同时根据已有序列设计合适的通用引物，为后续基于DNA条形码的浮游动物物种组成监测、食物网营养关系研究奠定基础。

1 材料与方法

搭载第25次和28次中国南极科学考察大洋调查航次，使用浮游动物垂直拖网和浮游生物高速采集器取样。垂直拖网所用网具为孔径330μm的北太平洋网，站位详细情况见图1。采集的样品去除大型游泳动物后固定在95%的优质酒精中，酒精体积为样品体积的4—5倍并定期更换酒精，样品保存在－20℃冰箱中备用。鉴定后的样品分两份保存于－80℃冰箱和福尔马林中，前者用于分子生物学研究，后者作为备份样品存档。

图1 本研究中浮游动物的采样站位（红色圆点）Fig.1.Regions sampled and collection locations for samples barcoded in this study.Sample stationswere represented by the red dots

使用Qiagen公司微量组织样品试剂盒（货号：56304）提取基因组DNA。为了提高PCR扩增的成功率，共设计了2组通用引物，正向引物为 coxf：GGTCCTGTAATCATAAAGAYATYG，反向引物分别为 coxr1：GCGACTACATAATAAGTRTCRTG和 coxr2：TCTATCCCAACTGTAAATATRTGRTG，扩增长度分别为830 bp和1 050 bp。反应采用50μL体系，条件如下：94℃ 5 min；94℃ 1 min，42—47℃ 30 s，72℃1.5 min，36个循环；72℃ 10 min。扩增产物经电泳验证后送往南方基因公司作双向测序分析。

使用clc main workbench的默认参数拼接序列，获得的序列均提交NCBI的GenBank，序列索引号如附表1所示。此外，DNA条形码种类鉴定有效性分析中还导入了GenBank中13种30条南极常见浮游动物DNA条形码序列，其索引号见附表1。使用MUSCLE默认参数比对序列，比对结果使用Paup*v4b10计算条形码序列两两间的遗传距离（p-distance）。得到的结果利用本课题组编写的perl脚本分析种内、种间遗传差异，并使用spss v18进行分析。使用MEGA 5.0构建最大邻接（Neighbor-joining，NJ）树，自举500次验证节点支持度。根据Sirovich的方法，使用matlab（2011a）分析南极浮游动物DNA条形码的示踪向量（indicator vector），从而直观显示不同类群的遗传差异及其关系［18］。

利用获得南极浮游动物DNA条形码以及Gen-Bank南大洋常见海洋无脊椎动物的mtCOI序列，比对后使用oligo 7设计兼并引物，从而提高对多个类群种类的扩增效率。引物为 ICO140U：TCAACAAATCATAARGAYATHGG和ICO820L：CACTTCNGGGTGACCRAARAAYCA。引物由南方基因公司合成，使用上述条件扩增32种极地浮游动物mtCOI序列，并通过凝胶电泳检测验证扩增效率。

表1 本研究采样种类名称及样品信息Table 1.Species of Antarctic zooplankton analyzed for this study，with specimen voucher numbers（voucher），collection information（location），and GenBank accession numbers（acc.）

续表1

2 结果

2.1 序列特征

本研究共获得隶属于5个门19科24属共计32种海洋浮游动物的mtCOI序列94条（NCBI登录号：KC754377—KC754470），其中节肢动物门覆盖桡足类、、磷虾和介形类四个主要类群。由于酒精保存样品中胶质浮游动物形态特征破坏严重，且DNA在更换酒精过程中大量流失，因此本研究未获得水母类和海樽的DNA条形码序列。根据使用的引物，扩增产物长度存在差异，约为830 bp到1 050 bp；比对后得到长度为800 bp的共有序列，插入缺失位点12个（indels），均出现在软体动物门的编码序列中，这可能反应了该类群线粒体基因组的独特进化历程［19］。在110条序列的比对结果中，核苷酸 A、C、G、T的平均含量分别为25.6%，16.5%，20.9%和37.0%，A＋T含量远高于G＋C含量，与线粒体基因组AT偏好的特征一致。不同种类间核苷酸组成差异显著（PAUP*；p＝0），主要是由第三位密码子的高摆动性造成的。

2.2 条形码间隙验证

具备合适分化速率的基因即可成为物种鉴定的理想标签，当种内变异速率远远小于种间变异速率时，两个分类单元在遗传种内和种间差异不会发生重叠，形成条形码间隙（Barcoding gap），这是 DNA条形码有效性的理论基础。本文比较了南极南大洋35种浮游动物的mtCOI序列，已确认是否存在条形码间隙。本研究中mtCOI遗传差异分布范围较广（图 2），从 0—48.8%，平均值为 27.6%（SD＝8.5%）。种内遗传差异普遍较小，分布于0—2.6%之间（图2），平均值为 0.67%（SD＝0.67%），94%的种类种内最大遗传差异＜1%。同属近源种间遗传差异分布在0.1%—29.3%之间（图2），平均值为 15.3（SDSD＝8.4%）。哲水蚤属（Calanus）中近缘哲水蚤（C.propinquus）和 C.simillimus的 mtCOI序列相似度非常高，其最小差异仅为0.64%，其他类群同属内近源种间遗传差异均＞9.5%。虽有部分重叠，但种内、种间遗传差异显著（t检验，F＝469.1，df＝442，p＝0），条形码间隙明显（图 2），总体而言，我们的结果表明，基于mtCOI序列的DNA条形码分析可以实现南极绝大部分桡足类的种类鉴定，哲水蚤属内种间遗传差异异常偏低的原因将在讨论中加以分析。同一科内不同属遗传差异为9.2%—27.1%之间，平均值为 20.9%（2.7%），该范围与同属不同种间遗传差异的分布范围重叠。在目以上分类单元，90.3%以上的种间遗传差异＞29%。

图2 南极常见浮游动物mtCOI序列不同阶元下遗传差异水平的分布情况.柱状图使用左侧纵坐标，线图使用右侧纵坐标轴.黑色实心柱标示种内遗传差异，黑色斜线柱标示同属内近源种间的遗传差异，灰色柱标示同科内不同属间的遗传差异，虚线标示整个样品的遗传差异分布Fig.2.Frequency distribution of genetic divergence（p-distance）ofmtCOIgenes for pairwise comparisons between individuals of all barcodes（dashed line），individuals within the same species（black boxes），between congenic species（white boxes）and between genera within the same family（grey boxes）

2.3 基于DNA条形码的分子系统树

在根据南极浮游动物DNA条形码序列构建的最大邻接树（图3）中，总共生成了34个由短枝连接的单系群，分别代表一个分子操作分类单元（MOTU），其节点自举支持度（Bootstrap）均 ＞99。除了近缘哲水蚤和C.simillimus杂糅在同一单系枝，其他单系群均标示单一物种。与遗传差异分析结果一致，由于在属和科水平DNA条形码所使用的mtCOI序列并不存在显著差异，进化趋向饱和，mtCOI序列无法准确解析科属水平浮游动物的系统分化。同一属或科的物种并不能准确聚在一起。但在更高分类阶元，不同类群间显示出高水平的遗传差异，研究涉及到的7个浮游生物类群（桡足类、毛颚类、类、多毛类、磷虾类、软体动物和介形类）的单系性均得到了解析。但由于背景噪音，各大类群所在进化枝的节点支持度都不高。

2.4 南极浮游动物DNA条形码的示踪向量分析

示踪向量分析方法是分析DNA条形码数据的新方法，针对南极浮游动物DNA条形码分析的结果如图4所示。与分子系统树和条形码间隙分析的结果一致，除近缘哲水蚤和C.simillimus无法准确区分种类外，其他各种类均聚为深红色的色块。桡足类、磷虾类、类和介形类内部序列相似度相对较高，聚成亮色色块，软体动物和毛颚类则具有较高水平的内部遗传分化，色块暗淡。各类群对应色块表示的相似度与其在分子系统树中进化枝的长度一致，mtCOI序列在不同类群的进化速率存在显著差异。

图3 基于124条cox1序列构建的35种南极海域浮游动物样品的无根邻接树（使用最大似然模型计算遗传距离）.节点数字代表1 000次自举检验得到的节点置信度Fig.3.Unrooted mtCOI gene tree for 124 specimens belonging to 35 Antarctic zooplankton species reconstructed by neighbor-joining with maximum-likelihood distances.Bootstrapping were done for 1 000 replications

2.5 新引物对南极浮游动物样品的扩增成功率

使用新设计的引物扩增32种南极浮游动物mt-COI序列得到的胶图如图5所示，全部浮游动物的模板均可以得到预期长度的扩增产物，且亮度满足后续测序要求。而利用相同的模板，使用Folmer引物的扩增成功率不足60%，且获得产物的条带相当模糊。

3 讨论

3.1 近缘哲水蚤（C.propinquus）和 C.simillimus极低种内遗传差异的意义

本研究中南极浮游动物DNA条形码的目的基因为线粒体细胞色素c氧化酶第一亚基编码基因，该基因具有母系遗传、多拷贝存在和变异速率适中等优点［7］，其种类鉴定的功效已在浮游动物不同类群种类鉴定中得到了检测［15，20-23］。根据已有研究结果，浮游动物种间遗传差异通常大于10%，即便两似种的遗传差异也大于5%，而种内遗传差异则通常 ＜4%［13，15，20］。桡足类中，种间遗传差异通常 ＞5%，种内遗传差异则＜4%，95%以上的种类种内遗传差异 ＜2.5%［11］。本研究中近缘哲水蚤和 C.simillimus遗传差异最大仅为 2.9%，最小则为0.2%。根据已有报道，哲水蚤属种间遗传差异为7%—25%［24］，因此本研究中两种哲水蚤的遗传差异属于种内水平。此外，分子系统树和示踪向量分析均指示近缘哲水蚤和C.simillimus在mtCOI基因上并未发生分化。

图4 针对35种南极浮游动物124条DNA条形码的示踪向量分析结果（以Klee图显示）.横坐标标示预测得到的物种，暖色标示具有更高的相似性，横坐标数字代表的种类见图3Fig.4.Vector analysis of 124 barcodes belonging to 35 species（Resultswere shown as a Klee diagram）.Higher similarity was visualized by warmer colors.Species names represented by the numbers on the x-axiswere given in Fig.3

图5 使用新设计的兼并引物对南极32种浮游动物的扩增效果图（梯度代表D2000标记）Fig.5.Representative agorose gel electrophoresis of PCR products amplified from 32 Antarctic zooplankton samples using degenerate primer set.Ladder represents a D2000 marker

近缘哲水蚤和C.simillimus都是南大洋浮游桡足类的重要组成部分，其分布范围存在重叠。近缘哲水蚤主要分布在高纬度的极地海域［25］，而C.simillimus则主要分布于亚南极区海域和极地锋面区［26］，这与本文两个种类的采样位置一致。个体大小是区分两个种类的最直观依据；除此以外，第五胸足形态方面有一定的区别。两者的区别主要表现在，近缘哲水蚤个体显著大于C.simillimus；其雌性第五胸足内侧小齿形态也与后者存在细微差异（http：∥copepodes.obs-banyuls.fr／）。近缘哲水蚤和C.simillimus外形极为相似，幼体期两种甚至无法区分［27］，以至于C.simillimus起初被当做近缘哲水蚤，至1902年才被划分为独立的种类。为了确保本研究中种类鉴定的准确性，样品鉴定时仅选择雌性成熟个体，此外还解剖了对应样品的第五胸足，发现确实存在上文描述的差异。

然而基于mtCOI基因的比较却显示两个种类共享同一种单倍型，近缘哲水蚤和C.simillimus的遗传分化甚至小于近缘哲水蚤种内的遗传分化，结果并不支持不同形态的样品存在种间遗传分化。本研究进一步比较了GenBank中C.simillimus与本文获得两种哲水蚤的遗传相似性。结果显示GenBank序列与本文获得的C.simillimus序列完全一致；取自南大洋大西洋海区的C.simillimus（GenBank）与近缘哲水蚤也不存在遗传分化。由于采样的样品量都不足10只，采样不够系统，且仅仅使用了单一分子标记（mtCOI），缺乏核基因的验证，本研究无法确认近缘哲水蚤和C.simillimus是否为同种异名。

哲水蚤属是目前桡足类中研究最多的一个类群，该属内已发现多个种存在争议。根据mtCOI基因［28］和线粒体16S rRNA编码基因［29］的研究结果，C.helgolandicus和 C.euxinus很可能是同一个物种。此外，中华哲水蚤（C.sinicus）与C.agulhensis的物种分化也遭到了质疑，Kozol等［30］使用 mtCOI、18S rRNA和28S rRNA分析了两个种类不同种群的个体，发现两种缺少遗传分化。由此可见，“种间”低水平的遗传分化在哲水蚤属中并非特例。近缘哲水蚤和C.simillimus的差异主要体现在数量性状上，而这种差异具有很强的环境可塑性［28］。本文的研究结果已对C.simillimusvs种的地位提出了质疑，在今后的研究中有待使用多个基因位点结合形态和生活史特征验证近缘哲水蚤和C.simillimus的分类地位。

3.2 DNA条形码是鉴定南极浮游动物的有效工具

除近缘哲水蚤和C.simillimus外，本研究中其他浮游动物的种内遗传差异均显著小于种间遗传差异，条形码间隙明显。研究结果表明，与北极［15］、近岸海湾［13］以及暖温带大洋［20］一样，使用 mtCOI序列作为DNA条形码在南极进行浮游动物物种组成研究是完全可行的。利用DNA条形码，可以区分存在争议的两似种。本研究中，基于形态学很难准确区分的 Themisto antarctica和 T.gaudichaudii以及Alacia belgicae和A.hettacra均可以使用DNA条形码实现准确鉴定，上述物种在常规调查中均未加以甄别［26，31］。

除了快速、准确，基于DNA条形码最大优点是无需待检测样品保存关键形态特征，这使得利用DNA条形码实现幼体鉴定和肠道内含物分析成为可能。在南极海域，已有使用DNA条形码研究浮游幼体的相关报道［9，17］，虽然由于背景数据库尚不完善，许多幼体无法具体鉴定到种，但比较传统形态学分析方法，在识别精度上仍有大幅提升。利用DNA条形码，Janosik等［32］对 Labidiaster annulatus的浮游幼虫生活史有了更进一步的认识。而基于DNA条形码的南极浮游动物摄食研究也已开展。Tobe等［33］使用分子探针研究南极大磷虾的摄食，发现长腹剑水蚤属是其主要摄食对象。相信在包括本研究在内的南极浮游动物DNA条形码相关研究的推动下，DNA条形码数据库将会越来越完善，从而推动该技术在南极浮游动物生态学研究中的应用［8］。而高通量测序技术的普及使得基于宏遗传组方法的浮游动物快速检测成为可能［16］。

此外，我们发现包括Calanus propinquus／simillimus，长臂樱磷虾（Thysanoessa macrura），戈氏长腹水蚤（Metridia gerlachei）以及北方乳点水蚤（Pleuromamma borealis）种内遗传差异较大，超过1.5%。其中北方乳点水蚤遗传差异显示出一定的地理分化，西风带采集样品与普里兹湾外海域采集样品遗传差异最大。上述结果表明，DNA条形码序列还可以提供种内遗传变异的信息，进而研究浮游动物关健种在南大洋不同海区的遗传分化，从而更好地揭示海冰、洋流等对浮游动物种群补充的影响。类似的工作已在南极大磷虾（Euphausia superba）［34］、钩虾（Orchomene sensu）［35］等多个类群中取得了进展。南极地区海洋无脊椎生物的基因流远比预想要小，种群遗传分化乃至隐种发生也许普遍存在。

3.3 新引物为南极浮游动物宏遗传组学研究提供有力工具

Folmer的通用引物极大地推动了DNA条形码计划的开展，然而由于该引物不含有兼并碱基，因此在不同类群中的扩增效率差别很大［12］，甚至无法成功扩增部分种类的mtCOI序列［17］，从而造成观测结果的偏差，影响浮游动物群落物种组成分析的准确性。在本研究的模拟实验中，使用Folmer引物仅有60%的种类可以得到清晰的扩增条带，如用于宏基因组方法的群落组成分析可能导致物种丰度的低估。由于考虑了不同类群的序列差异，本研究设计的兼并引物对南极海域常见浮游动物的扩增效率较为一致，成功率也更高，更适于基于单一基因的宏基因组分析。传统测序方法中，兼并引物无法直接测序，需要提前建库，因此费时费力，这是传统测序通常摒弃兼并引物的原因，而高通量测序方法则规避了这一不利因素。更为均一的扩增效率也使得根据不同DNA条形码表达丰度进行物种丰度估算成为可能。

4 总结

（1）南极海域哲水蚤属的两个常见种近缘哲水蚤和C.simillimus形态高度相似且遗传差异细微，本研究结果显示有必要使用包括核基因组位点，结合形态、生活史特征研究C.simillimus是否为近缘哲水蚤的地理种群。

（2）本研究结果验证了DNA条形码在南极浮游动物种类鉴定中的有效性。同时，部分物种较高水平的种内遗传差异表明DNA条形码还可以用作相关物种的种群遗传学研究。北方乳点水蚤极地海域和西风带海域的种群可能存在遗传分化，极地锋面可能是造成种群隔离的因素。

（3）新设计的兼并引物具有更为均一的扩增效率和成功率，结合高通量测序，必将为基于DNA条形码的环境样品宏遗传组分析提供有力工具。

致谢 作者感谢陶振铖、杨光两位同仁在样品采集和鉴定过程中给予的大力帮助。

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