二硫键氧化还原酶类似蛋白的研究进展

杨文静(综述)，胡文秀，方启晨(审校)

(1.苏州大学，江苏 苏州 215006； 2.上海市糖尿病研究所/上海市糖尿病重点实验室/上海交通大学附属第六人民医院内分泌科，上海 200233)

二硫键氧化还原酶类似蛋白(Disulfide-bond-A oxidoreductase-like protein,DsbA-L)又称GST-Kappa或谷胱甘肽S转移酶K1(glutathione S-transferase kappa 1,GSTK1)，具有谷胱甘肽-结合活性和谷胱甘肽-过氧化物酶活性。近年研究发现，它能与脂联素相互作用，促进脂联素的多聚化和分泌[1]。DsbA-L水平与肥胖症以及内质网应激呈负相关，并且能缓解由内质网应激诱导的脂联素水平下降。此外，DsbA-L基因多态性与胰岛素分泌及脂肪分布相关。该文从DsbA-L结构、功能及其与脂联素之间的关系等几个方面综述如下。

1 DsbA-L的发现及结构特点

DsbA-L即GSTK1，由Harris等[2]从大鼠肝脏线粒体基质中分离纯化获得，研究发现它有谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GSTs)活性，并与可溶性GSTs中Theta类成员GST12-12存在36%的相似性，被归于GSTs家族的Theta类，用GST13-13表示。1996年Pemble等[3]对大鼠GST13-13的cDNA进行分析，发现其氨基酸序列与GSTs的其他成员相比同源性甚低，且缺乏可溶性GSTs成员所共有的SNAIL∕TRAIL(Ser-Asn-Ala-Ile-Leu/Thr-Arg-Ala-Ile-Leu)基序，故将GST13-13作为GSTs家族新的一类，GST-Kappa。

然而，对GSTs基因家族进行结构和功能分析发现，GSTK1基因不属于GSTs基因家族成员[4]，并且GSTK1与细菌的2-羟基苯并氢(化)吡喃-2-羧化盐(2-hydroxychromene-2-caboxylate,HCCA)异构酶和二硫键氧化还原酶A(Disulfide-bond A oxidoreductase，DsbA)在一级序列和二级结构上有较高的同源性[5-6]。DsbA是硫氧还原蛋白家族的一个亚族，在细菌的分泌蛋白折叠过程中具有催化二硫键形成的作用[7]，而HCCA异构酶也属于DsbA家族，涉及原核生物多芳烃代谢分解通路[8]。晶体结构分析同样显示，GSTK1和DsbA具有相似的三维结构，且与其他GSTs家族成员显著不同[6]。2008年Liu等[1]研究发现,GSTK1在促进脂联素多聚化和分泌方面具有关键作用，结合既往的研究结果，将其重新命名DsbA-L。

DsbA-L是相对分子质量为25×103的二聚体[2]。类似于真核生物的蛋白二硫键异构酶，DsbA-L包含两个硫氧还蛋白样(thioredoxin-like)结构域，但缺乏DsbA家族成员所共有CXXC(C：半胱氨酸；X：任何氨基酸)活性中心，而该活性中心在二硫键的氧化形成和还原异构过程中起关键作用。值得注意的是，DsbA-L在相应于DsbA的这个CXXC氧化还原活性中心的地方则存在一个SXXS(S：丝氨酸；X：任何氨基酸)序列[1]，此序列在人、大鼠、小鼠及线虫等物种间相当保守，提示SXXS序列存在重要功能。

2 DsbA-L基因及其组织表达

大鼠和小鼠的DsbA-L基因分别位于染色体4q23和6B2.1，均由8个外显子组成，其编码蛋白的DNA长度分别为4.3 kb和4.1 kb，此两个种属的DsbA-L基因的外显子序列、外显子侧翼的拼接点序列以及内含子的长度高度相似[9]。人的DsbA-L基因位于染色体7q34，也包含8个外显子，全长5.68 kb[9]。人GSTK1基因编码区与大鼠和小鼠GSTK1的cDNAs的同源性为77%，然而人DsbA-L基因5′端非编码区序列与啮齿类动物之间无同源性，提示人与啮齿类动物DsbA-L表达可能存在不同的调控机制[10]。对小鼠GSTK1基因的启动子区域进行研究发现，在翻译起始点上游的-971～-111 bp片段是小鼠GSTK1基因的启动子的重要区域[11]。

Jowsey等[9]发现大鼠和小鼠DsbA-L的信使RNA(mRNA)在心、肝、肾和骨骼肌中高表达，在脑和肺则为低表达，而在脾脏和睾丸中表达水平最低。Thomson等[12]对小鼠肝脏及肾脏样本的电镜分析显示，DsbA-L位于其肝脏和肾脏细胞的线粒体上。人DsbA-L的mRNA在组织中普遍表达，在肝脏、肾脏和前列腺中较丰富；进一步的体外研究显示，人DsbA-L蛋白在细胞的过氧化物酶体和线粒体表达[10]。2008年Liu等[1]发现，GSTK1蛋白在小鼠和人的脂肪组织中均为高表达，且表达水平在肥胖时显著下降。

3 DsbA-L与脂联素

脂联素是一种由脂肪细胞分泌的脂肪因子，具有增强胰岛素敏感性，抗炎和抗动脉粥样硬化等多种功能。脂联素含有胶原样结构域和球形结构域，在血浆中它以低相对分子质量的三聚体、中等相对分子质量的六聚体和高相对分子质量的多聚体三种形式存在。脂联素通过其球形结构域形成三聚体，两个三聚体通过第39位半胱氨酸间的二硫键形成六聚体，六聚体作为一个结构单位以束状样结构形成由12～18个六聚体组成的多聚体[13]。不同的多聚体具有不同的生物学作用，研究表明高相对分子质量多聚体是脂联素代谢作用的主要活性形式[15]。脂联素的多聚化受损不仅可导致其分泌和功能的缺陷，而且与2型糖尿病及胰岛素敏感性关系密切[13-15]。脂联素生物合成与分泌的调控机制目前尚不明确。

2008年Liu等[1]发现，DsbA-L与脂联素之间存在相互作用，在前脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中DsbA-L和脂联素的表达同时显著增加。在3T3-L1脂肪细胞中过度表达DsbA-L可增加高相对分子质量脂联素水平，并促进脂联素的分泌；通过RNA干扰技术抑制DsbA-L的表达，则导致脂联素表达及分泌减少、高相对分子质量脂联素与低相对分子质量脂联素比值显著降低，而且这个抑制作用对脂联素是特异的，对其他脂肪因子(如廋素和抵抗素)的表达水平并无显著影响。研究还发现，DsbA-L的SXXS保守序列(16Ser-Pro-Tyr-19Ser)对其调控脂联素多聚化具有关键性的作用，Ser16的突变可阻止DsbA-L与脂联素的结合，影响DsbA-L对高相对分子质量脂联素形成的促进用[1]。这些结果提示：DsbA-L与脂联素的关系密切，在脂联素的形成和分泌中扮演重要角色。

一系列研究显示，噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)药物可以提高血浆脂联素水平[16-17]。TZDs是过氧化物酶体增生激活受体 γ(peroxisome proliferatoractivated receptor γ,PPARγ)的配体，可激活核转录因子PPARγ从而调节基因的转录。PPARγ被认为是促进脂联素生物合成的调节因子，其确切机制尚不十分明确。有研究显示，TZDs促进高相对分子质量的脂联素合成及分泌增加，而对脂联素的mRNA水平无影响，提示TZDs诱导的脂联素水平增高可能发生在翻译后水平[18-19]。Liu等[1]发现，TZDs 在增加DsbA-L表达的同时，也使高分子质量脂联素的形成以及脂联素的分泌增加，而且DsbA-L表达改变对脂联素的mRNA水平无显著影响；研究还发现，DsbA-L促进脂联素的分泌和多聚化，而对于存在二硫键形成缺陷的脂联素(C39S突变脂联素)，DsbA-L既不能增加此突变脂联素的表达，也不能促进其多聚化。因此，DsbA-L可能作为分子伴侣或蛋白折叠催化酶调节脂联素的组装和分泌。TZDs通过激活PPARγ上调DsbA-L，由此提供有利于蛋白折叠的环境，从而促进脂联素的多聚化以及分泌。

最近发现白藜芦醇可以促进脂联素的多聚化和表达[20]。研究显示，白藜芦醇上调DsbA-L的mRNA水平，但对脂联素的mRNA水平无显著影响[20]。提示白藜芦醇是通过调控DsbA-L的表达，从而增强脂联素的多聚化及分泌。

4 DsbA-L与内质网应激

内质网是蛋白质合成与翻译后修饰、多肽链正确折叠与装配及转运的重要场所。来自内质网上核糖体的新生肽链进入内质网管腔，经过信号肽切除、N-糖基化修饰、二硫键形成、与分子伴侣结合等，折叠成稳定的二级及三级结构。内质网的氧化环境以及在其中的多种蛋白分子伴侣对于膜蛋白和分泌蛋白(如胰岛素、脂联素)的正确折叠和装配是必需的[21]。很多因素(如低氧、脂质过度负荷、化学毒素等)可导致内质网生理功能发生紊乱，形成内质网应激。内质网应激与肥胖、糖尿病关系密切。研究发现，肥胖会诱导内质网应激，且内质网应激与脂联素水平降低相关[22]，在肥胖、2型糖尿病患者中血浆脂联素水平显著降低[23]，然而肥胖以及内质网应激在下调脂联素中的作用目前仍不明确。

DsbA-L是目前发现的与脂联素存在相互作用的蛋白之一，可促进脂联素的多聚化和分泌。DsbA-L在脂肪组织高度表达，但在肥胖小鼠和人的脂肪组织中DsbA-L表达均显著降低[1]，那么DsbA-L与肥胖所致的低脂联素血症与内质网应激之间是否存在联系？2010年Zhou等[24]的研究发现，db/db小鼠和高脂饮食诱导的肥胖小鼠均存在内质网应激，其血清脂联素水平以及脂肪组织中DsbA-L表达水平显著降低；用牛磺熊去氧胆酸缓解内质网应激后，db/db小鼠和高脂诱导的肥胖小鼠的低血清脂联素水平和DsbA-L低表达均得到改善。细胞水平的研究显示，内质网应激可下调DsbA-L的表达，并且影响3T3-L1脂肪细胞的脂联素水平及其分泌[24]。在3T3-L1脂肪细胞中过表达DsbA-L，则可缓解内质网应激以及内质网应激所致的脂联素水平下降和高相对分子质量脂联素的降低；在3T3-L1脂肪细胞中用RNA干扰抑制DsbA-L表达，可致细胞发生内质网应激、脂联素水平以及高分子质量脂联素显著降低[24]。这些结果提示，内质网应激在肥胖诱导的脂联素下调中具有重要作用，DsbA-L促进脂联素的装配和稳定性，并且改善内质网应激对脂联素多聚化和分泌水平的影响。肥胖引起的DsbA-L降低，可能导致内质网中错误折叠的脂联素增加，从而影响高分子质量脂联素的形成和分泌。

5 DsbA-L基因变异与糖脂代谢

2009年Gao等[25]根据HapMap计划公布的中国人单核苷酸多态性数据库和美国国立生物技术信息中心数据库中的数据，选择DsbA-L基因的一个单核苷酸多态位点-1308G→T，在1045例上海地区社区人群中对该变异与2型糖尿病和肥胖及其中间性状进行了关联研究。结果发现，-1308G→T不仅与体脂分布相关，而且与胰岛素分泌相关。然而，在研究中未发现-1308G→T变异与血清脂联素水平以及高分子质量脂联素水平相关。由于脂联素的生物合成及分泌和多种因素(如肥胖、内质网应激、脂联素基因变异等)有关，DsbA-L基因变异在其中可能仅是微效作用，变异与脂联素的相关性需要在更大人群中作进一步研究。2010年Shield等[26]报道，对194例不同种族人群(94例高加索人、50例非洲人及50例中国人)DsbA-L基因变异检测，仅发现在5′端非编码区存在两个单核苷酸多态位点：-1308G→T和-1032 G→C；进一步的研究发现在-1308处存在一个法呢醇X受体/视黄醇X受体转录因子结合位点，-1308G→T的变异使得DsbA-L基因启动子活性在人肝癌细胞增加了55%，而在人胚肾293细胞则降低了59%。这个在不同细胞系存在不同影响的结果提示，-1308G→T变异可能是调控DsbAL表达以及DsbAL作用发挥的一个重要遗传调节因素。此外，-1032 G→C变异改变了DsbAL基因的甲基化位点，-1032C容易发生甲基化；-1032G→C的变异导致DsbAL转录活性在人肝癌细胞和人胚肾293细胞均下降38%。

6 展 望

肥胖症、糖尿病等代谢性疾病是由基因及环境因素共同参与、相互作用的复杂病，与糖脂代谢紊乱、炎性反应和细胞应激等关系密切。脂联素具有抗动脉粥样硬化、抗炎、降血糖及增强胰岛素敏感性等特点，对糖、脂代谢的调节具有重要作用，在治疗2型糖尿病和肥胖方面有广泛的前景。DsbA-L是近年发现的一个调节脂联素的多聚化的关键蛋白，并可以缓解由于内质网应激诱导的脂联素水平下降。因此，DsbA-L是一个具有广泛前途的药物新靶点，对于其作用机制的深入研究将为治疗各种代谢疾病提供一个新的途径。

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