应用酵母双杂交方法筛选与猪瘟病毒Npro蛋白相互作用的宿主蛋白

董 泓，李 素，贺 番，廖亚金，何文瑞，孙 元，罗玉子，胡永浩*，仇华吉*

(1.甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730000；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种急性、热性、高度致死性传染病，给养猪业造成严重的经济损失。CSFV 为有囊膜的单股正链RNA 病毒，属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员，基因组长约12.3 nt，仅含有一个开放阅读框，编码由3 898 个氨基酸组成的多聚蛋白，该多聚蛋白可裂解为11～12 个成熟的病毒蛋白(NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH)[1]。

作为瘟病毒属特有的半胱氨酸样蛋白酶，Npro能以自催化的方式从正在翻译的多聚蛋白上断裂并成熟，其切割位点在Cys168-Ser169之间[2]。缺失Npro基因后导致CSFV 致弱[3]。Npro在调节宿主I 型干扰素(IFN)信号通路方面发挥重要作用[4]，如Npro诱导IFN 调节因子3(IRF3)以蛋白酶体依赖的方式降解[5]，Npro能够与IRF7 相互作用并调节其活性从而抑制树突状细胞内IFN 的产生[6]。最新研究表明，Npro与宿主Poly(C)结合蛋白1[Poly(C)-binding proteins1，PCBP1]相互作用并促进CSFV 的增殖[7]。进一步研究Npro与宿主蛋白的相互作用有助于对CSFV 致病机理的深入研究。

本研究采用酵母双杂交方法，从猪外周血单个核细胞(PBMC)酵母表达文库中筛选得到12 个与CSFV Npro蛋白相互作用的宿主蛋白，这些蛋白将成为深入研究CSFV 致病机制的良好素材。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 CSFV 石门株、PBMC 酵母表达文库、酵母菌株Y2H、大肠杆菌感受态细胞DH5α、HEK293T 细胞均由本实验室保存；pEYFPN1 购自Addgene 公司；限制性内切酶、DNA 聚合酶和连接酶均购自TaKaRa 公司；X-treme GENE HP DNA 转染试剂购自Roche 公司。

1.2 重组质粒的转染 按转染试剂盒说明书方法，将重组质粒转染于密度为80 %～90 %的单层HEK293T 细胞中，置于37 ℃5 % CO2条件下培养。

1.3 酵母双杂交筛选相互作用蛋白 以CSFV 石门株cDNA 为模板，采用引物5'-GCGAATTCATGGA GTTGAATCATTTTGAAC-3' 和5'-GCGTCGACTTAG CAACTGGTAACCCACAATGGAC-3'扩增编码Npro蛋白的基因，构建重组质粒pGBKT7-Npro(BD-Npro)，将其转化酵母菌株Y2H，验证毒性。同时，将BD-Npro与pGADT7(AD)共转化Y2H，验证诱饵蛋白的自激活活性。应用酵母双杂交方法筛选与BD-Npro相互作用的蛋白，具体步骤参考文献[8]的方法。

1.4 共转化验证筛选阳性克隆 将上述试验筛得的阳性重组捕获质粒与BD-Npro共转化感受态酵母菌Y2H，以排除假阳性。同时，设阳性对照pGBKT7-p53(BD-p53)+pGADT7-T(AD-T)、阴性对照pGBKT7-λ(BD-λ)+AD-T 和自激活对照pGBKT7(BD)+重组捕获质粒。

1.5 绘制CSFV Npro蛋白与宿主蛋白相互作用关系图 根据酵母双杂交筛选或已报道的与CSFV Npro相互作用的宿主蛋白，应用Cytoscape 2.8.2 软件，绘制CSFV Npro-宿主蛋白相互作用关系图。

1.6 Gene Ontology(GO)分析 在UniProt 数据库中检索目的蛋白的登录号，应用分析工具STRAP 进行GO 分析。

1.7 双分子荧光互补(BiFC)试验 将重组质粒pYN-Npro(Npro基因与EYFP N-末端融合后连接于pEYFP-N1)和pYC-PCBP1(PCBP1 基因与EYFP C-末端融合后连接于pEYFP-N1)(各1 μg)或pYN-Npro和pYC-Fibrillarin(Fibrillarin 基因与EYFP C-末端融合后连接于pEYFP-N1)(各1 g)共转染HEK293T，于37 ℃5 % CO2中培养，24 h 后利用Zeiss Axiovert 200 荧光显微镜观察活细胞内蛋白质间的相互作用[9]。

2 结果

2.1 酵母双杂交筛选及共转化验证 构建的酵母诱饵质粒BD-Npro经验证无自激活现象和细胞毒性。BD-Npro为诱饵，与酵母文库进行杂交，得到多个候选阳性菌落，将阳性捕获质粒和诱饵BD-Npro共转化感受态酵母菌Y2H 进行验证，并设立阴阳性对照，最终筛选获得12 个相互作用蛋白(图1)。

2.2 构建蛋白质相互作用关系图 应用Cytoscape 2.8.2 软件，根据筛选或已报道与Npro相互作用的蛋白绘制CSFV Npro-宿主蛋白相互作用关系图，图中结点代表蛋白质，结点间直线代表蛋白质间相互作用，黄色结点代表CSFV 蛋白，绿色结点代表已经报道与Npro相互作用的蛋白质，剩余结点代表本实验筛选得到的蛋白质(图2)。

图1 共转化验证与Npro 相互作用的宿主蛋白Fig.1 Panning the Npro-interacting host proteins by co-transformation

图2 Npro 与宿主蛋白质相互作用关系图Fig.2 Interactive analysis of Npro and Npro-interacting proteins

2.3 筛选获得蛋白质的功能分析 根据UniProtKB数据库的注释进行GO 分析，筛选得到的12 个相互作用宿主蛋白中有11 个参与细胞生命活动，6 个参与细胞代谢，6 个参与细胞生长、发育，5 个参与生物调节，2 个参与免疫调节，与生殖、细胞死亡和细胞防御有关的各1 个(表1)；分别发挥催化、酶活性调节、信号转导、转录调节、运输和抗氧化等生物学功能，还有的参与组成细胞骨架(表1)。

2.4 BiFC验证CSFV Npro与部分宿主蛋白的相互作用 为了在活细胞中直接观察Npro与已筛选蛋白的相互作用，将质粒pYN-Npro和pYC-PCBP1 或pYN-Npro和pYC-Fibrillarin 共转染HEK293T 细胞，24 h 后用Zeiss Axiovert 200 荧光显微镜观察活细胞内蛋白质间的相互作用，结果显示，共转染的实验组能显示黄色荧光，而其余的均无荧光(图3)，表明Npro与PCBP1 或Fibrillarin 存在相互作用。

表1 与Npro 相互作用蛋白GO 分析Table 1 Bioactivity profile of the Npro-interacting proteins with GO analysis

图3 BiFC 验证Npro 与PCBP1 或Fibrillarin 间相互作用Fig.3 Identification of the interaction between CSFV Npro and host proteins of PCBP1/Fibrillarin by BiFC assay

3 讨论

目前鲜有关于CSFV Npro蛋白和宿主蛋白相互作用的报道，仅发现Npro与IRF3、IRF7、IκBα、HAX-1和PCBP1 等少数蛋白相互作用[5-7,10-11]。酵母双杂交方法是一种广泛应用于筛选相互作用蛋白的方法，具有高通量，操作简便，阳性率高等优点[12]。通过该方法，本研究从PBMC 酵母表达文库中筛选得到12 个与CSFV 石门株Npro蛋白相互作用的宿主蛋白，GO 分析结果表明，这些蛋白质分别在细胞代谢、细胞生长发育、免疫调节、细胞死亡和细胞防御等方面发挥功能。其中，UBE3A 是E3 泛素连接酶，它以硫酯的形式将泛素从E2 泛素连接酶转移至底物；UBE2H 是E2 泛素连接酶，它将E1 泛素连接酶复合物中的泛素转移至底物，这表明，Npro蛋白可能参与细胞蛋白的泛素化修饰。LGALS9 能结合半乳糖苷，抑制细胞增殖，诱导I 型辅助T 淋巴细胞(Th1)的死亡，其对CSFV 增殖的影响值得进一步研究。β-actin(ACTB)是细胞骨架的重要成分，在细胞生命周期中也扮演着重要角色[13]，除CSFV Npro蛋白它还能与CSFV E2 蛋白相互作用[9]。

BiFC 是一种简便直观的验证蛋白质间相互作用的方法，能够在最接近生理状态的情况下实时观察两蛋白相互作用情况并且空间分辨率高[14]，本研究应用该方法验证了CSFV Npro与部分筛得宿主蛋白(PCBP1 或Fibrillarin)之间确实存在相互作用。

本研究应用酵母双杂交方法筛选出多种与CSFV Npro相互作用的宿主蛋白，深入研究这些蛋白与CSFV的关系有利于揭示CSFV 的致病机制。

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