用高效液相色谱法测定灯盏花中槲皮素的含量

张燕菊，刘智敏，许志刚

（昆明理工大学理学院，云南昆明 650500）

用高效液相色谱法测定灯盏花中槲皮素的含量

张燕菊，刘智敏，许志刚＊

（昆明理工大学理学院，云南昆明 650500）

分别采用溶剂回流提取和超声提取两种方法对灯盏花样品中的槲皮素进行提取，优化了提取条件，并用高效液相色谱进行了定量分析，采用扫描电镜分析了提取样品的表面形貌.结果表明：两种方法的提取率分别为0.048 7mg／g和0.042 3mg／g，溶剂回流的提取效果略优于超声提取；回流提取时的高温有利于提取物的溶出，而超声提取节能、快速.与此同时，采用两种方法提取的样品表面都受到明显的侵蚀，且回流提取时的机械搅拌促进样品的破碎，这些都有利于槲皮素的溶出.

灯盏花；槲皮素；提取；高效液相色谱；测定

槲皮素是一种存在于水果、蔬菜和中草药等植物中的植源性黄酮类化合物，尤其在茶叶［1－2］、洋葱［3］、山楂［4］中含量较高.槲皮素具有抗氧化性和清除自由基的作用，能抗癌、消炎、祛痰、止咳、平喘、降血压、降血脂［5］.灯盏花是云南的特色中草药之一，有重要的药用价值，其主要成分有灯盏花乙素、灯盏花甲素和槲皮素等黄酮类化合物.目前，有关灯盏花中灯盏花素的研究报道较多［6－7］，而有关灯盏花中槲皮素的研究报道较少.黄洪波等人 首次从灯盏花中分离提取到槲皮素，李菁等人 也从灯盏花中首次分离出槲皮素－3－O－β－D－葡萄糖苷，并进行了结构鉴定.然而，目前还没有文献定量报道灯盏花中槲皮素的含量.本文作者采用溶剂回流和超声提取两种方法提取灯盏花中的槲皮素，优化了提取条件，并用高效液相色谱进行测定，为灯盏花中黄酮类化合物的有效利用提供参考.

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

实验仪器：Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司），C18色谱柱（J＆K Scientific LTD，5 μm，4.6mm×250.0mm），FEI Quanta 200扫描电子显微镜（荷兰FEI公司），PS－20超声波清洗机（东莞市洁康超声波设备有限公司），N－1001型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），SC－04型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），HH－S数显恒温水浴锅（金坛市华城开元实验仪器厂），FA2004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）.

主要试剂：灯盏花购于昆明市菊花村中药市场（2012－03－07，由中国科学院昆明植物研究所标本馆鉴定），槲皮素购于陕西森弗高科实业有限公司（98%），乙腈为色谱级（西陇化工股份有限公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水，使用前经0.45μm滤膜过滤.

1.2 实验方法

将灯盏花全草样品破碎，过200目筛.称取样品1.0g加入50mL圆底烧瓶中，加入一定量的溶液，分别采用超声提取和溶剂回流提取.提取完成后进行抽滤，滤渣重复提取一次，合并滤液并减压蒸除大部分溶剂，浓缩液在3 500r／min的速度下离心分离10min，提取液转入梨形漏斗中，用15mL的乙酸乙酯萃取两次，收集乙酸乙酯萃取液并浓缩至干，用乙醇提取液定容至10mL，高效液相色谱分析前经0.45μm滤膜过滤.

1.3 色谱条件

流动相为乙腈－0.2%磷酸溶液，体积比为30∶70，流速为1.0mL／min，检测波长为360nm，柱温为30℃，进样体积均为20μL，采用外标法定量.

2 结果与讨论

2.1 槲皮素的高效液相色谱分析

分别配制槲皮素系列标准溶液（浓度依次为0.05、0.5、1.00、2.50、5.00、10.00mg／L）进行HPLC分析，结果如图1所示绘制峰面积－浓度标准曲线，线性方程为Y＝－0.229＋0.929X，相关系数R＝0.999 2.

图1 1mg／L槲皮素的色谱分析图Fig.1 Chromatograph of 1mg／L quercetin standard solution

2.2 灯盏花中槲皮素的提取方法优化

分别采用溶剂回流提取法和超声提取法对灯盏花样品中的槲皮素进行提取，对提取溶剂、提取时间和固液比进行优化，并结合色谱分析结果比较两种提取方法的效率.

2.2.1 提取溶剂的优化

称取灯盏花样品1.0g若干份，采用不同浓度的溶液各15mL作为提取溶剂，分别进行沸水浴提取和室温超声提取，前者提取时间为60min，后者为15min，其余操作按1.2进行，用相应的提取液定容至10.00 mL，然后进行HPLC分析，分析结果如图2所示.槲皮素的提取率定义为1.0g样品中提取到的槲皮素的总量.结果表明，乙醇浓度（体积分数）为70%时，溶剂回流提取法的提取率最高，而乙醇浓度为50%时，超声提取的效率最高.优化结果也表明：提取方法不同，最优的提取溶剂也不相同.

图2 不同浓度乙醇提取液对槲皮素提取率的影响Fig.2 Effect of different concentration ethanol extraction solution on extraction ratio of quercetin

2.2.2 提取时间的优化

称取两份样品各1.0g，分别采用70%和50%的乙醇水溶液进行溶剂回流提取和超声提取时间的优化，前者分别考察30、45、60、75、90min，后者分别考察10、15、20、25、30min，分析结果如图3所示.结果表明，溶剂回流的提取时间对提取率的影响较大，提取时间为60min时提取率最高；而超声提取时间在10～30 min内，提取率基本不变，因此，两种方法的提取时间分别选择60min和15min.

图3 提取时间对槲皮素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction ratio of quercetin

2.2.3 固液比的优化

称取样品1.0g若干份，两种提取方法的固液比分别考察1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，分析结果如图4所示.固液比对溶剂回流法提取槲皮素的影响略有起伏，同时考虑到提取效率和溶剂用量的因素，选择最优固液比为1∶15；而对于超声提取，固液比为1∶20时，提取量趋于平衡，选择最优固液比为1∶20.

2.3 灯盏花样品中槲皮素的含量测定

分别采用溶剂回流提取和超声提取方法，在各自最优的提取条件下对灯盏花样品中的槲皮素进行提取，并用高效液相色谱进行定量分析（见图5），计算样品中提取出的槲皮素含量.分析结果表明，溶剂回流提取法灯盏花样品中的槲皮素提取率为0.048 7mg／g（RSD＝5.7%，n＝5），超声提取法的提取率为0.042 3 mg／g（RSD＝3.3%，n＝5），略低于前者，但后者耗时短.溶剂回流提取的效果优于超声提取的原因可能与提取的温度有关，高温加速了槲皮素的溶出，此外，磁力搅拌子的机械搅拌可能会进一步破碎样品.

2.4 灯盏花样品提取前后的扫描电镜图分析

对两种不同提取方法提取后的灯盏花样品与未经处理的灯盏花样品进行了扫描电镜对比分析，放大1 000倍的电镜图如图6所示.超声提取后的样品表面结构明显遭到破坏，并形成较多孔洞和坑洼，这可能是超声作用引起样品表面结构的破坏，但这对分析物的溶出是有利的，从而使提取率提高；溶剂回流提取后的样品表面结构同样受到严重破坏，这可能是由于搅拌产生的机械作用造成的.此外，沸水浴也加快了溶质的溶出，因此沸水浴回流提取取得了更好的提取效果.

图4 固液比对槲皮素提取率的影响Fig.4 Effect of solid－liquid ratio on extraction ratio of quercetin

图5 灯盏花中槲皮素的色谱分析图Fig.5 Chromatograph of quercetin in ErigeronBreviscapus

图6 灯盏花样品萃取前后的扫描电镜图Fig.6 Scanning electron micrographs of ErigeronBreviscapus

3 结论

分别采用溶剂回流提取和超声提取两种方法对灯盏花中的槲皮素黄酮化合物进行了提取，对提取条件进行了优化，并用高效液相色谱进行定量分析.两种提取方法的对比分析表明，溶剂回流提取的效果略优于超声提取.这可能是由于高温加速了槲皮素的溶出且磁力搅拌进一步破碎了样品，有利于槲皮素的快速溶出.因此，在提取灯盏花中的槲皮素时应尽量减小样品的尺寸并提高萃取的温度.

［1］许志刚，陈云丽，张仙丽，等.超声波提取－高效液相色谱法测定茶叶中的槲皮素［J］.昆明学院学报，2013，35（3）：66－68.

［2］刘 波，张浩科，宫海燕.反相高效液相色谱法测定新疆枸杞叶茶中芦丁和槲皮素的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（14）：92－94.

［3］陈代武，李杰红.微波辅助萃取－HPLC测定洋葱槲皮素技术的研究［J］.食品工业科技，2006，27（1）：101－106.

［4］王珍，李秀霞，李娇，等.高效液相色谱法测定山楂中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量［J］.食品工业科技，2013，34（9）：302－305.

［5］孙涓，余世春.槲皮素的研究进展［J］.现代中药研究与实践，2011，25（3）：85－88.

［6］许志刚，胡劲召，单法辉，等.灯盏花中灯盏花乙素的提取与高效液相色谱分析［J］.琼州学院学报，2012，19（2）：23－25.

［7］许志刚，刘智敏，杨保民，等.灯盏花中灯盏花乙素的提取与分析方法探讨［J］.昆明学院学报，2011，33（6）：81－84.

［8］黄洪波，包文芳，杨芳芳，等.灯盏花的化学成分研究［J］.沈阳药科大学学报，2001，18（4）：266－267.

［9］李菁，于德泉.灯盏花化学成分研究［J］.中国中药杂志，2011，36（11）：1458－1462.

Determination of quercetin inErigeronBreviscapusby high performance liquid chromatography

ZHANG Yanju，LIU Zhimin，XU Zhigang＊
（FacultyofScience，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650500，Yunnan，China）

Quercetin was extracted fromErigeronBreviscapusby solvent reflux extraction method and ultrasonic extraction method，respectively，and relevant extraction conditions were optimized.The extracted samples of quercetin were quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography，and their morphology was observed with a scanning electron microscope.Results show that the extraction efficiency of the two methods is 0.048 7mg／g and 0.042 3mg／g，respectively，and the solvent reflux extraction method exhibits slightly better extraction efficiency than ultrasonic extraction method.Besides，elevating temperature of solvent reflux extraction method helps to promote the extraction of quercetin，and ultrasonic extraction method has advantages of energy－saving and fast determination.In the meantime，the surfaces of the quercetin samples extracted by the two methods are both apparently eroded and mechanical agitation of solvent reflux extraction enhances the breakage of the extracted samples，thereby favoring the extraction of quercetin.

ErigeronBreviscapus；quercetin；extraction；high performance liquid chromatography；determination

O 657.7

A

1008－1011（2014）02－0140－04

2013－12－02.

国家自然科学基金（21205054），云南省应用基础研究项目（2011FZ043），昆明理工大学分析测试基金（20130568，20130562）.

张燕菊（1991－），女，本科生，从事色谱分析.＊

，E－mail：chemxuzg＠kmust.edu.cn.