马立克病毒强毒感染和疫苗免疫鸡组织病理学变化比较

田文霞，王 颖，喻 进，卢晓晓，宁官保，高文伟，赵宇军，高荣琨，闫 芳

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

马立克病（Marek＇s disease，MD）是由疱疹病毒科的马立克病病毒（Marek＇s disease virus，MDV）引起的鸡恶性肿瘤性疾病，以淋巴细胞组织增生，各内脏器官、外周神经、肌肉、性腺、虹膜、皮肤中单核细胞浸润及肿瘤为特征［1］。该病具传染性，于1907年首次报道。马立克病一直是引起鸡生长障碍和死亡的主要疾病之一，给养鸡业造成了严重的经济损失，全球每年由于MD所付出的代价是10亿美元～20亿美元［2］，疫苗的使用使鸡马立克病得到了明显控制，但是由于病毒变异株和强毒株的不断出现，即使正常免疫鸡群，马立克病也时有发生［3］。

研究表明，马立克病是一个经典的多因素影响的疾病，其表现为诸如宿主、病原和环境管理等一系列复杂因素共同作用的结果，而这种复杂性必然对其防控及其病毒毒力的进化产生巨大影响。在宿主方面，出壳时特异性母源抗体及雏鸡的疫苗接种状况是主要决定因素。国内外对MD疫苗研制、疫苗免疫机理及其免疫效果等已做了广泛研究，也相继研制出致弱疫苗、自然弱毒苗及火鸡疱疹病毒苗［4］，其中CVI988疫苗免疫效果好，应用最多，其在接种后3d～4d就已经出现免疫效应［5］。迄今为止，MD疫苗免疫机理研究虽仍不清楚，但马立克病疫苗免疫保护作用属于免疫学范畴［6］。Schat研究指出，鸡接种马立克病疫苗后出现的一系列反应与其病毒Ⅰ型毒株的致病机理相似，但并不造成免疫抑制。然而，免疫保护并不是百分之百有效，免疫失败情况时常发生［7-8］。究其原因，除病毒变异、疫苗病毒血清型与流行的MD病毒不相同外，还可能与疫苗保存方式、使用时稀释度等因素密切相关。

近年来，人们对于如何提高MD疫苗的免疫效果进行了大量的研究，但主要集中在疫苗免疫部位和免疫途径，关于疫苗本身对机体的影响研究较少。本试验研究马立克病病毒强毒感染和疫苗免疫鸡组织病理学变化，通过对不同时期组织器官病理学观察，比较马立克病CVI988疫苗在产生免疫力的同时是否有毒性，为提高疫苗的安全性、减少免疫失败提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 108只1日龄海兰褐公雏鸡为山西第一种鸡场（康牧禽业）提供。

1.1.2 马立克病毒 马立克病毒强毒京-1株血毒（LD50＝3.48）为北京市农林科学院畜牧兽医研究所产品（批号：200806），液氮中保存。

1.1.3 疫苗 CVI988疫苗（批号：JD298），液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 试验鸡分组、攻毒、饲养 将108只1日龄公雏鸡随机分为3组，每组36只。空白对照组（C组）腹腔注射0.2mL灭菌 Hank′s液；攻毒组（V组）将马立克病毒强毒京-1株血毒用灭菌 Hank′s液稀释20倍，每只鸡腹腔注射0.2mL［9］；疫苗免疫组（IA组）每只鸡腹腔注射CVI988马立克氏病疫苗0.2mL。

1.2.2 样品采集 分别于接种3、6、10、15、20、26、35、45、60d［10］后，每组各取4只鸡称重后剖检，并分别取肺脏、胸腺、骨骼肌、肾脏、睾丸、肝脏、心肌、腺胃、盲肠扁桃体、脾脏、法氏囊、骨髓、坐骨神经等组织于100mL/L中性福尔马林固定。

1.2.3 组织切片的HE染色与观察 各组织器官经梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，再经二甲苯脱蜡，梯度酒精下行至蒸馏水，用苏木精染色5min，5mL/L盐酸酒精分化，水洗，蓝化30s，伊红染色2min，梯度酒精脱水，树胶封片，光镜下观察病理组织学变化。

2 结果

2.1 试验鸡剖检观察

攻毒后早期未见异常变化，攻毒组鸡26d时，剖检可见腺胃乳头肿大，睾丸肿大，肾脏稍肿大（图1A、图1B和图1C）；35d时，除睾丸肿大，肝脏稍肿大外，法氏囊和胸腺萎缩，有的甚至退化（图1D）；45d后，有鸡只出现马立克病典型病变，一侧坐骨神经增粗，肝脏有肿瘤结节（图1E，图1F）；疫苗免疫组和对照组无可见的病理变化。

图1 攻毒组鸡临床剖检特征Fig.1 Characteristics of clinical anatomy in chickens challenged with Jing-1MDV strain

2.2 组织病理学观察

2.2.1 攻毒鸡组织病理学观察 攻毒后对鸡群在不同阶段进行组织病理学观察，结果显示，胸腺在接种15d～60d时皮、髓质淋巴细胞数量逐渐减少，呈空泡状的网状细胞增加，皮、髓质界限不清，胸腺小体消失，且弥散性分布多量形态不一的肿瘤细胞。

法氏囊在接种15d～60d时淋巴滤泡间的淋巴细胞逐渐增多，滤泡萎缩，滤泡皮质变薄，皮髓质淋巴细胞减少；滤泡中淋巴细胞稀疏，滤泡体积小，滤泡间成纤维细胞多（图2A）。

病毒接种6d后，脾脏动脉周围淋巴鞘、淋巴小结内淋巴细胞减少，动脉血管内皮增生，肌层结构不清；接种20d～60d时逐渐出现红髓大量淋巴细胞浸润、白髓淋巴细胞减少、脾小结不明显、白髓红髓界限不明显，出现动脉粥样硬化（图2B）。

肝细胞在病毒接种6d后颗粒变性，静脉周围有中小淋巴细胞、网状细胞浸润，小叶内出现局灶性增生；随后肝小叶呈局部丝网状，肝细胞索排列零乱，增生的淋巴细胞有核分裂相；接种45d后，肝索消失，肝细胞变性、坏死、甚至萎缩消失，淋巴细胞大量集聚，出现肿瘤细胞集聚灶。肿瘤细胞为大、中、小淋巴细胞，伴有出血，可见马立克细胞（图2C）。

肾脏在接种病毒15d时，肾小管间有少量淋巴细胞和红细胞，血管内有大量红细胞，并有大量围管性增生的肿瘤细胞。肾小管局部坏死，聚集不同形态的增生淋巴细胞，增生灶内出现少量网状细胞，并见马立克细胞。

从15d开始相继在骨骼肌和心肌肌纤维间有淋巴细胞呈浸润性增生（图2D）。

腺胃在15d时出现增生的淋巴细胞，26d时出现弥漫性细胞浸润，且随着时间的推移，逐渐由弥漫性细胞浸润向局灶性细胞浸润转变（图2E）。

神经组织在接种35d时神经纤维间水肿液内散在中小淋巴细胞及浆细胞，局灶性增生，其中有马立克细胞（图2F）。

图2 攻毒组鸡各组织器官组织学特征（400×）Fig.2 Histologic characteristics of different organs in chickens challenged with Jing-1MDV strain（400×）

2.2.2 疫苗免疫鸡组织病理学观察 疫苗接种3d后，机体的免疫器官特别是脾脏与对照组相比有明显差异。脾脏在3d～10d出现了明显的淋巴细胞增多，15d～35d动脉周围淋巴鞘脾小结增多明显；法氏囊出现淋巴细胞增多；6d～10d时胸腺组织变化明显，胸腺小体淋巴细胞增多；但26d后其他组织也与攻毒组相似有明显的淋巴细胞浸润，出现明显的免疫器官损伤与组织器官病变（图3A，图3B和图3C）。

图3 腹腔免疫组各组织器官组织学特征（400×）Fig.3 Histologic characteristics of different organs in chickens of immune group injected intra-abdominally with vaccine strain，CVI988/Rispens（400×）

3 讨论

研究表明，腺胃、肝脏在接种马立克病毒15d出现单核淋巴细胞浸润与Payne和Rennie结果一致［11］。在脾脏、胸腺和法氏囊15d时出现淋巴细胞减少，与刁秀国等［12-13］报道的1周出现单核淋巴细胞浸润、胸腺和法氏囊出现特征性病变，淋巴细胞流失有偏差，Buscaglia C等也发现感染后3～6d细胞溶解，认为MDV强毒感染鸡体后侵入淋巴器官，引起B淋巴细胞溶解，活化的T淋巴细胞也发生溶细胞现象，胸腺和法氏囊在6d～8d出现萎缩性病变［14］。这一结果在时间上存在差异，可能与毒株不同有关，该病特征性病变即各器官的增生细胞中出现马立克细胞。攻毒组中鸡肝脏、肾脏、腺胃、胰腺等内脏器官的变化，使机体正常生理功能发生紊乱，这可能是鸡只死亡的主要原因。

免疫组鸡接种疫苗后，脾脏变化较胸腺和法氏囊要迅速、持久，与对照组相比有明显差异，这与李爵等的研究结果相一致［4］。胸腺组织学变化与MDV在后期主要引起细胞免疫有关，本研究另一结果表明，CVI988疫苗接种第3天产生体液免疫效应，10d后细胞免疫效应高于对照组，即早期免疫效果主要靠体液免疫［15-16］，这充分印证了这一点，说明CVI988疫苗具有较强的免疫保护效应。但脾脏、法氏囊和胸腺出现类似攻毒组的病理变化，表明疫苗除具保护作用外，还存在一定的毒力。

另外，疫苗免疫组除免疫器官外，肝脏等组织都出现了不同程度的淋巴细胞浸润，与攻毒组变化相似，说明疫苗的毒力和强毒一样对机体的非免疫器官也会产生一定的影响。

综上所述，CVI988疫苗不仅具有免疫保护作用，而且也具有与强毒类似的毒力，可能对鸡的生长和免疫产生一定的影响。马立克病疫苗的毒力作用如何减弱或消除，研制无毒力且又免疫力强的马立克病疫苗，提高预防和控制鸡马立克病，以提高疫苗免疫效力还需要做进一步深入研究。

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