CD4+CD25+调节性T细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

曾美秀(综述)，苏 萍(审校)

(浙江萧山医院血液科，杭州 311202)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是B细胞恶性肿瘤，以分泌异常单克隆免疫球蛋白的浆细胞在骨髓内大量增生、聚集和免疫功能障碍为特征。传统的大剂量化疗和自体造血干细胞移植可提高患者生存率，新的免疫治疗策略中，独特型疫苗和以树突状细胞(dendritic cell，DC)为基础的免疫治疗呈现出有希望的前景，但目前仍难以治愈此疾病。CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群，在维持对自身成分免疫耐受的同时，也可能阻止机体对自体同源肿瘤细胞的免疫，导致肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸。该文就CD4+CD25+Tregs在MM中的研究进展予以综述。

1 CD4+CD25+Tregs的生物学特性及作用机制

1.1CD4+CD25+Tregs的生物学特性 CD4+CD25+Tregs是Tregs中的重要群体，占人类和鼠外周血CD4+T细胞的5%～10%，在人类除表达CD25外，还组成性表达叉头样转录因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体、CD122、CD103，同时还可分泌转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素(interleukin,IL)10等[1]。其中，FOXP3特定表达在细胞内，是Tregs发育、活化、发挥功能的关键，并且不受活化状态的影响，被公认为是Tregs的特异性标志，但近期研究发现许多活化的、不具有抑制功能的细胞也表达FOXP3，且还不清楚是否所有的表达FOXP3的T细胞都具有抑制功能[2]。随后，研究发现高表达于非调节性T细胞CD127在Tregs低表达，Hartigan-O′Connor等[3]用CD4、CD25、CD127三色抗体标记发现，人类、鼠及短尾猴外周血存在群体较清晰的CD4+CD25+/highCD127lowT细胞，它们高表达胞内FOXP3和CTLA-4，功能分析发现其具有抑制性、低增殖性和对T细胞受体信号的低反应性。CD4+CD25+Tregs可以分为两大类：一类是天然存在的Treg，它是在胸腺内产生并生存在周围组织中以阻止潜在的自身免疫反应；另一类是诱导产生的Treg，它的前体细胞也是从胸腺样组织衍生而来，是在不完全暴露抗原刺激的特定条件下，由幼稚的细胞在体内周围组织中激活后表达CD25分子而转化为 CD4+CD25+Tregs。

CD4+CD25+Tregs具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征，前者对IL-2特异性抗原及抗原呈递细胞的刺激呈低反应状态；后者在T细胞受体介导的信号刺激活化后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，且这种免疫抑制作用呈现主要组织相容性复合物非限制性及非抗原特异性。

1.2CD4+CD25+Tregs的作用机制 活化的CD4+CD25+Tregs可以广泛抑制体内多种细胞的增殖，如CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、DC、单核巨噬细胞和自然杀伤细胞的活性[4]。其以一种主动的方式调控机体的免疫应答，对自身抗原和非己抗原均有较强的免疫抑制作用。目前对Tregs介导的免疫抑制的分子基础还不是很清楚，认为可能通过以下几种途径发挥作用。

1.2.1细胞接触的调节 研究证实，CD4+CD25+Tregs在体外主要通过细胞-细胞直接接触的方式介导免疫抑制，而不依赖于细胞因子。中和TGF-β或IL-10作用免疫抑制不受影响，而将CD4+CD25+Tregs与CD4+CD25-反应性T细胞用半透膜隔离培养，则不能产生增殖抑制效应[5]。有趣的是，活化的CD4+CD25+Tregs经多聚甲醛固定后依然能保持抑制活性，提示细胞表面高表达的某种分子可能参与了该免疫抑制作用[6]。随后的研究表明，CTLA-4可能就是介导这种接触抑制作用的重要分子[7]，其跨膜分子胞内段携带酪氨酸抑制基序，与B7配接后传递抑制信号，抑制T细胞的增殖和活化。另外，CTLA-4与DC表面的CD80/CD86结合，通过逆向转导的信号导致DC内的吲哚氨-2，3-双加氧酶(indole-ammonia-2,3-dioxygenase,IDO)活化，IDO是色氨酸代谢所必需的酶，由于IDO的活化，使游离的色氨酸减少，从而导致T细胞的活化程度降低[8]。此外，CD4+CD25+Tregs在淋巴结或肿瘤部位亦可通过穿孔素/颗粒酶、Fas/FasL途径直接杀伤免疫效应细胞[9]。

1.2.2细胞因子介导的调节 研究表明，CD4+CD25+Tregs可通过分泌TGF-β，抑制CD8+T细胞和自然杀伤细胞对肿瘤的直接杀伤作用。CD8+T细胞表面存在TGF-β受体Ⅱ，与TGF-β结合后能激活胞内片段激酶结构域，随即发生磷酸化，可进一步活化细胞内信号转导蛋白家族，从而启动相关基因表达，发挥抑制活性。Smyth等[10]在小鼠中发现，无论是体内还是体外，Tregs都直接抑制了自然杀伤细胞激活性受体介导的自然杀伤细胞毒性作用，以此削弱对肿瘤细胞的杀伤。IL-10是介导Tregs免疫作用的另一个重要分子，其可通过抑制抗原呈递细胞有效抑制IL-12的产生，而IL-12是辅助性T细胞分化的关键因子。此外，IL-10还可下调主要组织相容性复合物Ⅱ类分子、单核细胞CD80、CD86和CD28配体的表达及阻止T细胞受体介导的CD4+T细胞的活化。

另外，CD4+CD25+Tregs还可通过在效应T细胞活化早期抑制IL-2产生并导致其免疫无能，抑制免疫效应细胞向肿瘤微环境聚集等途径，介导免疫抑制作用[11]。

2 CD4+CD25+Tregs与MM

2.1MM中Tregs的数量 近年研究已证实，一些实体性肿瘤(如胃癌、肺癌、肝癌等)中均发现CD4+CD25+Tregs数量增加,并且Tregs数量增加程度与肿瘤进展及较差的预后相关。MM患者外周血Tregs与MM发病及预后亦有关，初治的MM患者外周血Tregs增多，而在癌前病变阶段及缓解期的患者Tregs与正常人相比无显著差异[12]。Beyer等[13]研究发现，意义未明单克隆免疫球蛋白血症、MM患者外周血及骨髓CD4+CD25high/FOXP3+Tregs均较正常对照者显著增高。韩文敏等[14]通过流式细胞术检测外周血CD4+CD25highCD127lowTregs的结果与 Beyer等[13]的结果类似，且Ⅲ期较Ⅰ、Ⅱ期亦显著升高。对于MM患者 CD4+CD25+Tregs增高的原因，Beyer等[13]通过对细胞表面免疫表型分析发现，这些增高的Tregs并非因为胸腺产生过多，而是在外周循环扩增所致，至于是何种或哪些因素导致扩增，未进一步研究。韩文敏等[14]报道，MM患者血清TGF-β表达显著升高，但与升高的CD4+CD25highCD127lowTregs并无明显相关性,提示TGF-β并非MM患者体内Tregs增加的重要和唯一因素，可能与IL-10、血管内皮生长因子等因素有关，值得进一步研究。

2.2MM中Tregs的功能 研究表明，MM患者CD4+CD25+Tregs水平显著增高，那么增高的CD4+CD25+Tregs免疫调节功能如何呢?Prabhala等[15]比较MM及正常对照者Tregs抑制可溶性CD3单抗诱导刺激外周血T细胞增殖抑制作用，发现MM患者Tregs的免疫抑制功能显著减弱。而Beyer等[13]通过分析MM及正常者来源的高度纯化的CD4+CD25highTregs对异基因混合淋巴细胞反应及CD3/CD28刺激的T细胞增殖抑制作用发现，两组具有相同的抑制功能。分析比较上述研究的不同结果，可能与试验中所选择的方法不同有关，前者选择的是外周血单个核细胞中仅除去CD25+的剩余细胞，而后者选择的是高度纯化的CD4+CD25highT细胞，这就排除了包含在外周血单个核细胞中的其他细胞作用的影响。Strauss等[16]报道，头颈部鳞癌患者外周血单个核细胞及肿瘤浸润性淋巴细胞中CD4+CD25+/highTregs显著增高，比较两种不同来源CD4+CD25highTregs的免疫抑制功能发现，肿瘤浸润性淋巴细胞者对CD3/CD28诱导的免疫增殖抑制作用更强，且这种作用主要由自体T细胞分泌的TGF-β及IL-10介导，而不依赖于细胞接触，但细胞接触可对抑制作用进一步增强。总之，MM作为免疫效应细胞的肿瘤，免疫功能异常是导致其发生、发展的重要原因和严重后果，而MM患者体内异常的Tregs构成了肿瘤免疫耐受网络的关键成分，可能是免疫抑制的重要原因。

2.3Tregs与MM免疫治疗 近年来，随着造血干细胞移植以及新药(如硼替佐米、雷利度胺)的应用，MM患者的治疗缓解率及生存时间得到了显著提高，但肿瘤耐药及复发仍是MM治疗的一大困境。在MM新的免疫治疗策略中，独特型疫苗和以DC为基础的免疫治疗成为研究热点，在大鼠模型研究中显示，独特型疫苗诱导产生了抗骨髓瘤的保护性免疫。Hansson等[17]应用MM患者自体M蛋白独特型疫苗联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及IL-2免疫Ⅰ～Ⅱ期MM患者，结果发现大部分受试者在诱导期均能产生独特型特异性T细胞反应，而CD4+CD25+Tregs显著升高的患者未产生，因此猜测可能是增高的CD4+CD25+Tregs免疫负调控抑制了独特型免疫反应的产生。Tregs与DC之间也存在复杂的关系。体外研究中，成熟DC可有效扩增抗原特异性的Tregs，反过来，Tregs能够抑制未成熟DC的抗原递呈能力[18]。另外，Tregs的CTLA-4与DC表面 CD80/CD86结合，诱导DC上IDO的上调，抑制了T细胞增殖，诱导了T细胞凋亡[8]。熊红等[19]及丁岩松等[20]报道，应用自体骨髓瘤细胞全抗原或M蛋白独特型疫苗负载DC或糖基化修饰的DC疫苗都可以诱导有效的抗肿瘤免疫应答，并杀伤自体骨髓瘤细胞，显示出明显的抗骨髓瘤作用。然而相关临床试验效果却令人大失所望，究其原因，可能是MM患者体内增高的Tregs导致DC功能抑制以及DC诱导Tregs扩增，减弱了以DC为基础的免疫治疗作用。

因此，如何抑制Tregs活化、增殖，提高免疫细胞的抗肿瘤免疫，是目前克服骨髓瘤耐药及复发的重要手段之一[21]。目前用于清除或抑制Tregs作用的途径主要有：①用特异性抗体或Ontak(一种IL-2与毒素的融合蛋白)清除CD25+Tregs；②FOXP3疫苗,小鼠模型显示，该疫苗能活化FOXP3特异性的细胞毒性T细胞，从而清除Treg细胞，增强抗肿瘤作用[22]；③研究证实,CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide)能与人Tregs上的Toll样受体8结合，通过Toll样受体8-髓样分化因子88-白细胞介素1受体相关激酶4信号通路来逆转Treg的抑制作用[23]。但值得注意的是，这些方法大多为非特异性的，可将识别肿瘤抗原或自身抗原的CD4+CD25+Tregs全部抑制或去除，这也可能使机体罹患自身免疫性疾病。目前应用于MM治疗的药物(如环磷酰胺、氟达拉滨、雷利度胺等)均被证实具有清除MM患者Tregs的作用[24-25]。在对硼替佐米治疗移植物抗宿主疾病研究中证实,其可通过抑制核因子κB通路抑制T细胞增殖、活化，对人体外周血Tregs有抑制、清除作用[26]。最近李滢等[27]研究发现,接受硼替佐米化疗后,MM患者的Tregs水平下降更显著，提示硼替佐米对MM患者的Tregs具有抑制作用，其通过解除机体免疫抑制的微环境来增强细胞免疫的抗肿瘤能力、重建细胞免疫间的平衡稳态而达到良好地清除肿瘤的功能；而对于原发耐药患者外周血Tregs的清除作用较少，化疗疗效不佳，提示抑制Tregs的增殖与功能仍是改善治疗的关键因素之一。

3 结 语

MM至今仍难以治愈，严重危害人类健康，近年来随着对其免疫缺陷及免疫治疗策略的研究，免疫治疗呈现出有希望的前景。CD4+CD25+Tregs是具有免疫负调节作用的重要T细胞亚群，目前在MM中的作用越来越受到关注。虽然MM患者体内Tregs升高的原因及其发生免疫作用的机制还不十分清楚，但研究表明Tregs与MM病程进展、预后及免疫治疗存在密切联系，为MM治疗提供了新的方向。

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