代谢物组学在肾病研究中的应用

吴 琼，董 昕，陈啸飞，洪战英，柴逸峰

[1.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室，上海 200433；2.第二军医大学药学院分析测试中心，上海 200433；3.第二军医大学药学院，上海 200433]

肾的作用在于维持酸碱平衡，调节血容量及激素分泌，对于脊椎动物的体内稳态非常重要。肾病是以肾小球基底膜通透性增高为主的症候群，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症及全身水肿。肾病的病理机制复杂，目前主要依赖于有限的血清、尿液生化指标，肾组织病理学，免疫组化及临床表现进行诊断和治疗，缺乏足够的灵敏度和专属性[1]。如临床常用血肌酐(serum creatinine,Scr)表征肾功能，而Scr的应用存在很多不足。(1)Scr升高前肾损伤已经发生；(2)在肾小球滤过率较低的情况下，仅根据Scr易高估肾功能；(3)单用Scr无法推测疾病的发生机制；(4)Scr易受年龄、性别、肌肉代谢等混杂因素的影响。目前还未出现一种足够灵敏和专属的技术用于肾病早期诊断、疾病进程预测及疗效评价。因此，寻找更为专属的肾病标志物用于肾病的早期诊断及预后评估非常重要。

代谢物组学是系统生物学的分支，通过全面的定性定量分析，对代谢物在机体处于正常生命状态及内外环境变化后的动态反应进行研究[2]，通过高分辨的分析方法结合多元数据分析可获取内源和外源代谢物的全景图像[3]，在生物标志物筛选及治疗方案选择方面展现了很好的应用前景[4]。代谢物组学的研究对象为体内所有小分子代谢物，包括代谢中间体及终产物，相对分子质量大多<1 ku。代谢物组学的检测技术涉及色谱、质谱、电泳及核磁共振等，主要是基于色谱质谱联用和核磁共振两大类检测技术，其优势在于能同时表征表型和基因型的变化。与传统的肾穿刺活检术相比，代谢物组学具有病人易接受、安全、可连续采样的优点，可以非创伤性地获得生物体液进行临床疾病的早期诊断，为疾病分型、预后分析及个体化用药提供帮助和支持[5]，并且其在不同肾病专属性标志物及代谢途径方面的探索极大地促进了肾病机制的研究[6]。

1 代谢物组学在肾病研究中的应用

肾病的发生、发展与全身性的代谢异常密切相关。代谢物组学在肾病研究中具有不可忽视的临床价值。

1.1 在急性肾损伤研究中的应用 急性肾损伤是一种流行性强且进展迅速的临床疾病，常伴随较高的发病率和病死率。在过去的50年里，尽管急性肾损伤在临床护理上有显著发展，但结局改善甚微[7]，限制临床结果改善的最主要因素之一在于缺乏精确预测和诊断早期肾功能紊乱的方法。目前临床上用于急性肾损伤诊断的金标准为小便排出量和Scr，这两个指标均存在不够灵敏、专属，疾病预测滞后等缺点。Liu等[8]对急性肾损伤病人体内的代谢变化做了深入研究，证实了氧化应激和脂类代谢的紊乱在急性肾损伤中所起的作用，并且通过快速LC-MS的血清代谢物组学研究发现与急性肾损伤相关的新标志物，如上调的溶血磷脂、游离脂肪酸和硝基酪氨酸，以及下调的肉碱和乙酰肉碱。另有研究表明，上调的酰基肉碱以及蛋氨酸、同型半胱氨酸、焦谷氨酸、不对称二甲基精氨酸、苯丙氨酸等氨基酸，下调的精氨酸和几种溶血性磷脂酰胆碱都与急性肾病相关，其中同型半胱氨酸、不对称二甲基精氨酸和焦谷氨酸已经被筛选为诊断肾病的生物标志物[9]。

1.2 在慢性肾病研究中的应用 肾小球滤过率<60 ml/(min·1.73 m2)持续3个月及以上的状态被定义为慢性肾病。代谢产物如Scr和血尿氮常作为肾功能的标志物，目前还没有大规模的健康志愿者和慢性肾病病人代谢物组学方面的临床对照研究[10]。血清代谢物组学研究表明，不同分型的慢性肾病病人内源性代谢物轮廓存在差异，这些代谢物主要包括糖酵解、氨基酸、有机渗透物等代谢产物。基于这些代谢产物所构建的慢性肾病诊断模型的灵敏度和专属性均可达到100%，鉴别的生物标志物可为慢性肾病诊断尤其是早期治疗提供有用的信息[11]。

1.3 在慢性肾衰竭研究中的应用 慢性肾衰竭是在各种慢性肾实质疾病的基础上，缓慢地出现肾功能减退而至衰竭。在慢性肾衰竭的进展过程中，尿毒素在体内的异常积聚起了重要作用[12]。Jia等[13]采用HPLC-MS法对慢性肾小球肾炎病人、未接受肾移植治疗的慢性肾衰竭病人，以及正常人的血浆磷脂代谢物做全谱分析，揭示19种磷脂类物质可能与疾病分型密切相关，慢性肾小球肾炎导致慢性肾衰竭病人的磷脂代谢发生改变。这些代谢轮廓的改变可用于慢性肾小球肾炎早期进展的检测，并为慢性肾衰竭的防治提供参考。

1.4 在肾脏恶性肿瘤研究中的应用 肾癌也叫肾癌，近年来，其发病率持续增加，一旦发病就会频繁转移，病人生存希望渺茫。肾癌通常是在诊断急性肾损伤或血尿病人时通过成像偶然发现，在这种情况下，肿瘤通常已经转移，转移性肾癌病人的生存期只有1～2年。 然而目前尚无有效的生化标志物可用于肾癌的诊断，主要依赖于成像技术，而这一技术并不能筛分肾癌的表型，因此早期诊断和检测尤为重要。研究发现，肾癌病人体内的乳酸盐、谷氨酸、丙酮酸盐、谷氨酰胺和肌酐水平上调，而乙酸盐、苹果酸和氨基酸(包括缬氨酸、丙氨酸及天冬氨酸)水平下调[14]。一种基于LC-MS的代谢物组学方法结合多元统计分析可以用于区分肾癌病人和健康志愿者的血清轮廓，检测灵敏度可达到100%，为肾癌的诊断和分型提供了支持，并且能够很好地区分早期与晚期病人。该研究共鉴别了30个肾癌相关的代谢物，主要涉及磷脂代谢、鞘脂代谢和苯丙氨酸代谢等。该研究也证实了代谢物组学在揭示癌症表型方面的潜能[15]。Kim等[16]用代谢物组学方法筛分了肾癌相关的尿液差异代谢物：喹啉酸、4-羟基苯甲酸和龙胆酸盐，这些代谢物主要涉及氨基酸代谢和能量代谢。今后，在更大规模的肾癌病人中开展代谢物组学研究可能验证潜在的生物标志物，并实现肾癌的早诊断、早干预。

1.5 在免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)肾病研究中的应用 IgA肾病是原发性肾小球肾炎病人发生慢性肾衰竭最常见的起因。目前临床上诊断IgA肾病主要依靠肾穿刺活检术，存在有创伤性、检查过程伴随疼痛、病人接受度低等缺点。Sui等[17]对IgA肾病病人进行了代谢物组学研究，鉴定了潜在的生物标志物。与健康志愿者相比，IgA肾病病人有较高水平的苯丙氨酸、肌醇、乳酸盐、L6脂类、L5脂类及L3脂类，以及较低水平的β-葡萄糖、α-葡萄糖、缬氨酸、酪氨酸、磷酸胆碱、赖氨酸、异亮氨酸、甘油磷酸胆碱、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、乙酸盐、3-羟基丁酸和1-甲基组氨酸。肾间质纤维化过程中的代谢异常主要涉及缬氨酸、异亮氨酸、乳酸盐、3-羟基丁酸、丙氨酸、乙酰乙酸、丙酮酸盐和谷氨酸等生物标志物，这些生物标志物将有助于病理机制的解释[18]。能量代谢在肾间质纤维化早期阶段被抑制而后期又被激活，这一现象也由代谢物组学研究所发现，为肾间质纤维化病理机制的探索提供了参考。

1.6 在常染色体主导的多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)研究中的应用 ADPKD是最常见的遗传性肾病，发病率约为1‰，其明显特征为肾囊肿扩大，最终导致肾衰竭。ADPKD的诊断主要依赖于超声和成像，然而这种诊断模式只能发现肉眼可见的囊肿，较为滞后，目前尚无生物标志物用于ADPKD的诊断。大量的尿毒素类化合物会随着肾损伤的进展持续积聚，继而导致肾损伤和高血压。特征标志物筛选研究对ADPKD的早期检测、病理过程阐述及减缓疾病进程非常必要。与ADPKD相关的代谢物主要包括上调的5-甲基-2′-脱氧胞苷、葡糖胺、(S)-2-甲基-1，4，5，6-四氢甲基嘧啶-4-羧酸(英文名ectoine)、尿囊酸盐、α-羟基苯甲酸盐、苯乙酰甘氨酸盐和3-苯基丙酸盐，以及下调的2-脱氧胞苷、癸酸和10-羟基癸酸[19]。Taylor等[20]研究发现了该疾病早期阶段显著改变的几条生物代谢路径，其中嘌呤代谢和半乳糖代谢最为显著。另外，也筛选出尿囊酸和腺苷等ADPKD专属性的潜在标志物，这些标志物及其代谢通路为建立非创伤性的ADPKD诊断方法，及新的治疗手段带来了新的希望。

1.7 在糖尿病肾病研究中的应用 糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是末端肾病的主要原因。目前，微量蛋白尿是诊断糖尿病肾病唯一的非创伤性的标志物。然而，有些病人检测出微量蛋白尿时，肾脏已有很严重的病理学变化，这一阶段的治疗效果明显差于疾病早期阶段。因此，筛选能表征糖尿病肾病早期阶段的生物标志物非常有意义。Zhao等[21]对糖尿病大鼠肾上皮样品做了代谢物组学研究，发现了一系列与糖尿病肾病相关的差异代谢物，包括氨基酸、碳水化合物、多元醇、溶血磷脂、葡萄糖醛酸苷以及多种无法鉴别的代谢物。其中，尿毒症毒素、葡萄糖醛酸苷以及葡萄糖毒性有关的代谢物表达上调，并与24 h蛋白尿水平、肾小管间质性损伤等糖尿病肾病损伤高度相关。Hirayama等[22]应用血清代谢物组学分析鉴别了可用于糖尿病诊断的一系列生物标志物。该研究发现，尿液中含有大分子蛋白尿和不含大分子蛋白尿的糖尿病病人有19种差异代谢物，包括肌酐、天冬氨酸、γ-丁基甜菜碱、瓜氨酸、二甲基精氨酸、犬尿素、壬二酸和半乳糖二酸。Han等[23]应用基于GC-MS的代谢物组学方法，评价血浆中酯化脂肪酸和非酯化脂肪酸的水平，并将该方法应用于150个糖尿病肾病病人的血浆分析，共鉴别了25个脂肪酸(包括酯化和非酯化的脂肪酸)，精确地测定了其中15种脂肪酸，并据此推测糖尿病肾病、糖尿病的病理机制与脂肪酸代谢之间的联系。

1.8 在原发性肾低尿酸血症研究中的应用 原发性肾低尿酸血症是一种不常见的肾病，主要特征为肾尿酸清除率增加，而这主要是由肾近端小管尿酸膜转运先天缺陷导致。Tzovaras等[24]以基于磁共振技术的代谢物组学方法对原发性肾低尿酸血症病人的尿液进行分析，以评价肾小管功能。在构建的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)模型中，原发性肾低尿酸血症病人与健康志愿者可明显地区分开，区分性变量主要包括下调的马尿酸盐、肌酐、三甲胺-N-氧化物，以及上调的苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、乙酸盐和一个尚未鉴定的代谢物。

2 总结和展望

肾病种类多样且病因复杂，可引起全身性内环境紊乱。代谢物组学可以非靶标地分析不同生物样本中所有的小分子代谢物，是筛选生物标志物的理想方法。本文分析了现存肾病标志物的不足，并介绍了目前代谢物组学在肾病早期诊断及预后标志物筛选中的应用。代谢物组学筛选的生物标志物较传统的临床生化和组织病理学方法能更早地检测肾病的发生、发展。因此，经济、快速、高通量的代谢物组学技术在肾病的个体化诊断及治疗领域显示出巨大的潜力和价值。然而，代谢物组学也存在一些不足之处。(1)由于代谢产物具有不均一性，相对分子质量、极性、挥发性、丰度均有差异；(2)代谢物组学平台建立的前处理及后续的分离检测方法无法完全覆盖所有的内源性代谢物；(3)后续的原始数据处理和信息挖掘也有待进一步改进；(4)单独依靠代谢物组学并不能完全阐述疾病进程中的生化异常。因此，今后的肾病代谢物组学研究必须首先优化代谢物组学分析平台，改善前处理和分离检测手段，发展更为先进的数据预处理及信息挖掘手段；其次联合系统生物学中的其他组学技术，全面详细阐述疾病过程中的生化异常。代谢物组学的发展增加了人们对疾病的认识，其与基因组学、蛋白质组学等结合对疾病机制进行科学阐述将是今后研究的热点[25]。

总而言之，在代谢物水平上全面表征肾病有助于更好地阐释肾病的发病机制，筛选更可靠的生物标志物用于诊断及个体化治疗。代谢物组学技术不但解决了以往自上而下的研究模式(从基因编码到转录修饰再到蛋白质表达)面临的挑战，即如何准确阐述组学数据的生物功能与临床现象的相关性问题，而且代谢物组学与代谢表型最为相关，对基因组学、转录组学和蛋白质组学做了很好的补充，从系统生物学的下游(小分子代谢物)出发，为肾病研究提供了新思路和新希望。然而，目前代谢物组学在肾病研究中的应用仍处于起步阶段，主要停留在生物标志物的初步筛选，在后续工作中必须对筛选到的生物标志物做进一步验证，最终应用于临床疾病的早期诊断及治疗干预，从而在肾病研究中发挥更大的优势。

【参考文献】

[1]Zhao YingYong.Metabolomics in chronic kidney disease[J].Clin Chim Acta，2013，422:59-69.

[2]Fiehn O.Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes[J].Plant Mol Biol,2002,48(1-2):155-171.

[3]Sun Hui,Zhang AiHua,Yan GuangLi，etal.Metabolomic analysis of key regulatory metabolites in hepatitis C virus-infected tree shrews[J].Mol Cell Proteomics,2013,12(3):710-719.

[4]Zhang AiHua,Sun Hui,Han Ying，etal.Exploratory urinary metabolic biomarkers and pathways using UPLC-Q-TOF-HDMS coupled with pattern recognition approach[J].Analyst,2012,137(18):4200-4208.

[5]Zhang AiHua,Sun Hui,Han Ying，etal.Urinary metabolic biomarker and pathway study of hepatitis B virus infected patients based on UPLC-MS system[J].PloS one,2013,8(5):e64381.

[6]Kikuchi K，Itoh Y，Tateoka R，etal.Metabolomic analysis of uremic toxins by liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(20):1662-1668.

[7]Slocum J L，Heung M，Pennathur S.Marking renal injury:can we move beyond serum creatinine?[J].Transl Res,2012,159(4):277-289.

[8]Liu Ye,Yan ShiKai,Ji ChengCheng，etal.Metabolomic changes and protective effect of (L)-carnitine in rat kidney ischemia/reperfusion injury[J].Kidney Blood Press Res,2012,35(5):373-381.

[9]Sun JinChun，Shannon M，Ando Y，etal.Serum metabolomic profiles from patients with acute kidney injury:a pilot study[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2012,893-894:107-113.

[10]Goek O N，Döring A，Gieger C，etal.Serum metabolite concentrations and decreased GFR in the general population[J].Am J Kidney Dis,2012,60(2):197-206.

[11]Qi SuWen,Ouyang Xin,Wang LinQian，etal.A pilot metabolic profiling study in serum of patients with chronic kidney disease based on1H-NMR-spectroscopy[J].Clin Transl Sci, 2012,5(5):379-385.

[12]Vanholder R，Baurmeister U，Brunet P，etal.A bench to bedside view of uremic toxins[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(5):863-870.

[13]Jia LeWen,Wang Chang,Zhao SuMin，etal.Metabolomic identification of potential phospholipid biomarkers for chronic glomerulonephritis by using high performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007,860(1):134-140.

[14]Gao HongChang,Dong BaiJun,Jia JianMin，etal.Application ofexvivo1H-NMR metabonomics to the characterization and possible detection of renal cell carcinoma metastases[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138(5):753-761.

[15]Lin Lin,Huang ZhenZhen,Gao Yao，etal.LC-MS based serum metabonomic analysis for renal cell carcinoma diagnosis，staging，and biomarker discovery[J].J Proteome Res, 2011,10(3):1396-1405.

[16]Kim K，Taylor S L，Ganti S，etal.Urine metabolomic analysis identifies potential biomarkers and pathogenic pathways in kidney cancer[J].OMICS,2011,15(5):293-303.

[17]Sui WeiGuo,Li LiPing,Che WenTi，etal.A proton nuclear magnetic resonance-based metabonomics study of metabolic profiling in immunoglobulin A nephropathy[J].Clinics(Sao Paulo)，2012,67(4):363-373.

[18]Zhang HaiYan,Jia JianMin,Cheng JinGuo，etal.1H-NMR-based metabonomics study on serum of renal interstitial fibrosis rats induced by unilateral ureteral obstruction[J].Mol BioSyst,2012,8(2):595-601.

[19]Toyohara T，Suzuki T，Akiyama Y，etal.Metabolomic profiling of the autosomal dominant polycystic kidney disease rat model[J].Clin Exp Nephrol,2011,15(5):676-687.

[20]Taylor S L,Ganti S,Bukanov N O,etal.A metabolomics approach using juvenile cystic mice to identify urinary biomarkers and altered pathways in polycystic kidney disease[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,298(4):F909-F922.

[21]Zhao Tie,Zhang HaoJun,Zhao TingTing，etal.Intrarenal metabolomics reveals the association of local organic toxins with the progression of diabetic kidney disease[J].J Pharm Biomed Anal,2012,60:32-43.

[22]Hirayama A，Nakashima E，Sugimoto M，etal.Metabolic profiling reveals new serum biomarkers for differentiating diabetic nephropathy[J].Anal Bioanal Chem,2012,404(10):3101-3109.

[23]Han LiDa,Xia JianFei,Liang QiongLin，etal.Plasma esterified and non-esterified fatty acids metabolic profiling using gas chromatography-mass spectrometry and its application in the study of diabetic mellitus and diabetic nephropathy[J].Anal Chim Acta,2011,689(1):85-91.

[24]Tzovaras V T，Psychogios N G，Kostara C E，etal.Evaluation of the proximal tubular function in individuals with primary renal hypouricemia:an NMR-based metabonomic study[J].NMR Biomed,2009,22(10):1072-1083.

[25]张 健，魏 昕，洪战英，等.代谢物组学在糖尿病研究中的现状与进展[J].药学服务与研究，2013,13(6)：401-404.

Zhang Jian，Wei Xin，Hong ZhanYing，etal.Current situation and progress of metabolomics in diabetes[J].Pharm Care Res，2013，13(6)：401-404.In Chinese with English abstract.