亚砷酸治疗急性早幼粒细胞白血病时砷代谢产物的分析

周 倩(综述),周 晋(审校)

(哈尔滨医科大学附属第一医院血液内科,血液肿瘤中心实验室,哈尔滨 150001)

砷是自然界中的一种有毒微量元素，医学上用砷剂治疗牛皮癣、梅毒、风湿病、非洲锥虫病等已有相当长的历史[1-2]。近年来，我国学者在使用亚砷酸治疗急性早幼粒细胞白血病(acute polymyelocytic leukemia,APL)方面已取得的进展令人瞩目[3]，亚砷酸治疗APL的疗效在世界范围内日益受到重视。但同时砷具有致畸、致突变、致癌的作用，在体内有一定的蓄积性，因此砷剂的不良反应一直很受人们关注。各种砷代谢产物在体内的浓度决定砷剂的疗效和毒性，因此对砷的分析检测非常重要。

1 自然界砷代谢产物的种类

砷元素及其化合物广泛存在于环境中,砷化合物进入生物地球化学循环，经过氧化还原、甲基化、硫化等一系列的反应，产生了无机砷、甲基砷、砷的氢化物、硫砷、砷糖、砷碱等不同形态的砷化合物[4]。元素形态的砷,由于其不溶于水,几乎没有毒性,有毒性的主要是砷的化合物，无机砷是砷众多形态中毒性最强的,甲基化砷的毒性较小,越是形态复杂的有机砷毒性越弱，如海产品中的总砷虽然含量高，但由于其中的主要砷成分为砷甜菜碱等复杂的有机砷，毒性小，一般不会引起中毒[5]。正是由于各种不同形态的砷具有不同的物理及化学性质，砷的代谢产物分析才越来越为人们所重视。

2 砷代谢产物浓度的检测方法

常见的分离富集砷的代谢产物方法有:气相色谱，高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC),毛细管电泳，超临界流体色谱。常用的检测方法有:紫外检测、原子吸收光谱(atomic absorption spectroscopy，AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)、电感祸合等离子体质谱(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)[6]、原子荧光光谱(atomic fluorescence spectrometry，AFS)等，原子荧光光谱运行成本低、仪器价格低廉、有便于维护的特点，电感耦合等离子体质谱则具有检测限低、有线性范围宽、稳定的优点[7-8]，但技术条件苛刻，所需的仪器太过复杂。另外，电分析法、中子活化分析等也被广泛采用。电分析方法简便经济，但干扰因素多，选择性差；色谱法尽管分离效率较高，但其常用检测器为非专一性检测器，灵敏度低，往往达不到要求。这说明单一仪器或技术很难完成砷形态分析的任务[9]。

目前在砷形态研究领域国内外专家先后采用HPLC和ICP-MS、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、HG-AFS、HG-AAS、ES-MS-MS等检测器在线联用的技术,成为砷形态分析的有力工具[10]，联用技术HPLC-ICP-AES、HPLC-AFS联用技术的研究发展较晚，但是由于该技术具有应用便捷和仪器造价相对较低、分析灵敏度高、选择性好的优点，且有学者认为HPLC-AFS与HPLC-ICP-MS的检测结果相互可以很好地符合[11-12]，其发展前景和应用前景广阔。

3 亚砷酸治疗APL时各种砷代谢产物分析

目前，国际上对亚砷酸治疗APL时各种砷代谢产物分析的研究较少，主要的研究报道例举如下。

尿液是砷的主要代谢途径之一，人体摄入的砷主要从尿液排出[13],尿样采集简单方便、基质干扰小,但尿砷的检测受各种因素(个体之间、饮食、测定分析方法等)的影响，因此有效的评价方法是尿液中砷的化学形态测定[14]。2004年，Wang等[15]首先报道了4例亚砷酸治疗的APL患者尿液中砷代谢产物分析情况，提示每日约60%的日剂量的亚砷酸随尿液排出，尿液中砷形态包括无机砷和甲基化砷；推测砷还可经其他排泄途径，如随汗液、胆汁等排泄。

2006年日本学者报道了1例患者的血样中砷代谢产物分析情况。该APL复发患者应用亚砷酸治疗，每日剂量为0.08 mg/kg，使用亚砷酸35 d诱导缓解治疗后达完全缓解。间隔55 d，使用亚砷酸进行巩固治疗，在巩固治疗的第4、5日，检测血清及尿液中的砷浓度来观察砷剂的药动学，其中无机砷及其甲基化代谢产物的浓度用HPLC测量。且采样前3 d患者限制进食海鲜产品，以免来自海产品的砷影响检测。检测结果显示，血清和尿液中三价无机砷，一甲基砷、二甲基砷，血浆中无机砷，一甲基砷、二甲基砷的总浓度为18～41 μg/L，尿液中总砷的浓度在第4日可达到4464 μg/d，表明作用在血清中砷的浓度在纳摩尔水平范围内就可以达到治疗APL的效果[16]。

2007年日本学者又描述了12例复发的APL患者血清中各种砷代谢产物分析的结果。给予亚砷酸0.15 mg/kg后，收集了患者的血浆和尿液标本，对无机砷和主要代谢产物一甲基砷和二甲基砷含量应用HPLC/ICP-MS进行定量分析。结果显示，血浆中三价和五价无机砷的浓度在第1日达到了相近的药物峰浓度值[(12.4±8.4) μg/L和(10.2±3.9) μg/L]，而甲基化代谢产物在血中的出现是延迟的。在重复给药期间，血浆的无机砷浓度达到一个稳定状态。相反，一甲基砷和二甲基砷浓度的增加与重复给药频率的增加有关。在第1日，总砷排泄率的均值大约是日剂量的20%，在1～4周则保持在日剂量的60%。这项研究证明亚砷酸经由静脉给予APL患者，给药后产生的甲基化代谢产物被血浆迅速清除并经由尿液排泄出去，因此在血液中不易检测到亚砷酸的蓄积[17]。

2009年有学者对经过诱导缓解治疗后以及处于巩固治疗期APL患者不同时间点的血样进行采集，以此来阐明砷剂代谢产物的变化规律。这例患者采用亚砷酸联合Am-80(一种视黄醇的衍生物)方法治疗。应用ICP-MS以及HPLC/ICP-MS法分别测定血细胞和血浆中总砷的含量以及血浆中无机砷和甲基化代谢产物的浓度。结果发现血细胞中总砷含量高出血浆中4～10倍。在所有的砷剂代谢产物中，血浆中的五价砷酸盐是最容易从体内清除的，故其浓度最低。在停药期阶段，三价砷的血浆浓度比一甲基化和二甲基化的砷酸盐下降得快。此外，检测巩固治疗期患者外周血及血浆中砷浓度，发现血浆中的砷和砷代谢物浓度随着时间增加而增加，有蓄积作用,由此认为亚砷酸的甲基化代谢产物在APL患者的治疗中起主要作用[18]。

随着APL患者生存期的延长,中枢神经系统白血病成为该病髓外复发、影响预后的重要因素[19]。对渗透入APL患者脑脊液的砷代谢分析报道提示，依据静脉点滴亚砷酸达完全缓解状态的APL患者血浆和脑脊液中的亚砷酸及其代谢产物浓度，可证明血浆中亚砷酸以与高分子量及低分子量蛋白结合的形式存在，其代谢产物似乎可以通过血脑屏障。亚砷酸治疗后脑脊液中可检测到一甲基砷，而且其浓度较血浆浓度高。亚砷酸输注后可以检测到三价无机砷和二甲基砷，但是脑脊液中砷代谢产物谷浓度较血浆低。这些结果表明，亚砷酸与其他化疗方法联合可能对中枢神经系统受累的APL患者有效，其中特定的砷成分(如一甲基砷)可能发挥重要作用[20]。

2012年日本学者对1例复发的APL患者静脉使用亚砷酸进行治疗，骨髓和外周血中的砷代谢物使用HPLC/ICP-MS进行定量分析，骨髓中一甲基砷和二甲基砷的浓度是逐渐增加的，从第42日后逐渐下降，其中二甲基砷含量比一甲基下降缓慢。然而无机砷的浓度仍然保持较低的水平，在使用亚砷酸后的14 d才逐渐增加，在第28日达到峰值，之后逐渐下降，到第56日含量已很微弱了，五价无机砷的浓度下降是最快的，浓度也是最低的，表明骨髓中砷代谢的情况与外周血中基本符合[21]，外周血的砷代谢情况可以提示骨髓中的情况。

唾液也是部分学者研究砷代谢的标本之一。2008年Yuan等[22]首次对砷暴露者唾液中砷形态进行检测，认为检测唾液中的砷可以反映砷代谢及蓄积情况。唾液腺血流量较高，化学品和代谢物可以通过被动扩散、主动转运、超滤等方式从血液聚集到唾液中，提示唾液也是测量砷的途径。2013年加拿大和中国学者对7例初治和2例复发的APL患者的唾液进行分析，9例患者均是静脉注射使用剂量为10 mg/d的亚砷酸，在使用亚砷酸后连续3 d对9例患者连续收集唾液标本，采集标本前APL患者需用去离子水彻底清洗口腔，共收集了108个标本。对无机砷和主要的代谢产物一甲基砷和二甲基砷含量使用HPLC/ICP-MS进行定量分析，对收集的标本进行统计分析发现在唾液中三价无机砷占总砷含量的71.8%，甲基砷仅占7.8%，此外随着砷剂每日的输入，唾液中甲基砷的含量逐渐下降，可能意味着砷的甲基化过程随着砷剂的大量输入趋于饱和。这一结果可表明唾液可以作为合适的临床样本来检测APL患者体内砷的含量[23]。

4 结 语

以上研究仅描绘了亚砷酸治疗APL时各种砷代谢产物在体内的浓度及变化规律，尚未涉及这种变化与亚砷酸疗效及不良反应的关系，但为这方面研究打下了理论和技术的基础，有助于医学工作者通过亚砷酸治疗APL时砷代谢产物的分析来设法减轻砷剂引起的不良反应并取得更好的治疗效果。APL患者体内关于亚砷酸的详细研究应该继续开展，以提供APL更好的治疗效果及不良反应监测方法。

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