酶学检测在法医学领域中的应用进展

吴开祥(综述)，孙文平，王学春(审校)

(泰山医学院病理教研室,山东 泰安 271000)

酶是生物体内催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体，是机体在新陈代谢活动中不可或缺的催化剂，广泛参与生命活动中物质代谢与能量交换等反应过程。当机体遭受各种损伤因素，如机械性损伤、化学性损伤甚至导致机体死亡时，体内不同组织细胞的酶含量和活性均会随之发生相应的变化，根据这一特点，酶学检测可应用于法医学相关领域的检验鉴定。该文就近年来酶学检测在法医学领域中的应用进展予以综述。

1 推断死亡时间

死亡时间(postmortem interval，PMI)的推断始终是法医学实践工作中的重点和难点。传统的PMI推断方法包括尸温测量、尸体现象、昆虫学数据及白骨化等手段。随着基础医学的迅猛发展，有关PMI推断的新方法、新技术逐渐被引入法医学领域，如血生化指标检验、玻璃体液分析、酶学检测以及遗传物质的含量变化等。迄今为止，这些方法仍然有其各自的特点和局限性，需要进一步的深入研究。

国内外学者对肝细胞酶活性随时间的演变规律进行了深入研究。Gos等[1]通过观察人死后肝内乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性变化规律发现，两者可用于晚期PMI推断。金菊等[2]利用免疫组织化学和图像分析技术研究了在不同PMI和死亡原因下大鼠肝脏组织内磷酸果糖激酶2水平的变化，结果发现三种不同死亡原因大鼠肝脏组织内该酶含量随PMI的延长呈规律性减弱趋势，可以作为推断PMI的指标。闫宜锋等[3]观察了不同温度下大鼠死亡后肝脏内5′-核苷酸酶的活性改变，结果发现大鼠死后21 h内5′-核苷酸酶活性与PMI呈明显负相关，故该酶的降解规律可作为推断PMI的参考指标。

玻璃体液中某些酶活性在死亡后表现出规律性改变，因此可以作为法医学推断死亡事件时间的手段之一。Henke等[4]通过研究发现，家兔死亡后玻璃体液中谷氨酰转移酶、肌酸激酶的活性变化与PMI具有一定的相关性。李兴彪等[5]发现家兔急性胰腺炎死后72 h内眼玻璃体液中淀粉酶含量变化可以为早期PMI推断提供客观的实验依据。王伟平等[6]则利用光度法检测不同温度下家兔玻璃体液中胆碱酯酶和谷草转氨酶活性降解规律，发现这两种酶活性变化可以用作推断死后54 h内PMI的较好指标。

PMI是表明案件的发生时间，对划定侦查范围、确定凶犯和犯罪嫌疑人有非常重要的意义。由于动物尸体与人尸体存在很大的差异，而且环境因素、个体差异、健康状况、死因不同及组织细胞的腐败自溶等条件均与PMI推断有关，因此在实际检案工作中，要进行综合分析。

2 推断损伤时间

Woertgen等[7]采用撞击模型研究了大鼠脑损伤后烯醇化酶随时间的演变规律，发现伤后其血清中烯醇化酶水平逐渐升高，于6 h达到峰值，随后逐渐下降，表现出明显的时间依赖性，故认为烯醇化酶可用于脑损伤形成时间的推断。随后陈仁辉等[8]采用弥漫性脑损伤模型，证实了该酶可用于早期法医学鉴定及损伤经过时间的推断。2010年，焦炎等[9]选取健康体检者和颅脑损伤者作为研究对象，证实脑外伤患者血浆烯醇化酶可作为早期检测创伤性颅脑损伤的特异性指标，其水平越高，颅脑损伤程度越重。杨静等[10]建立大鼠脑液压冲击伤模型，采用免疫组织化学与图像分析技术检测出大鼠脑损伤后半胱天冬酶亚类8的变化规律，发现其伤后30 min开始表达，随时间增加其表达亦逐渐增加，至24 h达到高峰后逐渐减少，2周左右基本恢复正常，这一演变规律为闭合性脑损伤的早期诊断及损伤时间推断提供了依据。郭晓冲等[11]则通过实验证实,大鼠脑挫伤修复过程中基质金属蛋白酶3的表达呈时序性变化规律，有望用于脑挫伤时间的推断。Harter等[12]、蔡红星等[13]研究发现，脑脊液中胱天蛋白酶3(caspase-3)活性诱导型一氧化氮合酶的表达变化可以在实际检案中作为脑损伤时间推断的有效依据。也有学者通过研究发现,caspase-3的规律性表达可用于皮肤切创和骨骼肌挫伤愈合时间的观察指标[14-15]。Saatman等[16]研究证实,在创伤性轴索损伤后，钙激活中性蛋白酶在数小时内短暂激活，伤后4 h可被再次激活。进一步的研究发现大鼠局灶性脑损伤后，损伤周边区的钙激活中性蛋白酶1和2的表达随时间呈典型的双峰变化，两者表达变化的时间规律可以为法医学实践中局灶性脑损伤时间推断提供相关的理论依据[17]。另外，也有学者通过研究发现，血红素加氧酶1可以作为诊断皮下出血时间进程的指标[18]。

3 对致伤(死)原因及机制的推断

余荣军等[19]利用SD大鼠损伤后血清检测肌酸激酶及同工酶、乳酸脱氢酶、肌酐、尿素氮等的变化，发现其血清含量随打击力度增加而上升。这些肢体软组织挫伤造成相关血清生化指标的显著变化，可为创伤性心肌损害提供理论依据。在对急性心肌缺血所致心性猝死的研究中，学者们发现血红素加氧酶1以及心肌细胞胞质中成纤维细胞激活蛋白α 和转化生长因子β1的联合表达检测可以作为法医尸检中判断死因的良好指标[20-21]。

Ikegaya等[22]发现，细胞色素C氧化酶可以用于氰化物中毒的诊断指标。步建衡等[23]研究发现，动态监测家兔非热低压电击伤后乳酸脱氢酶和羟丁酸脱氢酶活性的变化可为非热电击损伤的诊断、损伤时间推断提供理论依据。Nishio等[24]比较了胃促胰酶的含量在过敏性休克与非过敏性休克死者血清中的差异，发现过敏性休克死者血清胃促胰酶水平显著升高，认为胃促胰酶对过敏性休克的诊断有一定价值。进一步研究发现，血清免疫球蛋白E、类胰蛋白酶含量可对过敏性猝死的诊断有一定参考价值[25-26]。

4 体液分析

精子ABO血型的测定可利用酶标记抗体免疫组织化学法、酶标记单克隆抗体法等，经实践检验也证明了此类方法灵敏度高，重复性好，检材用料少，快速而准确。Voorhees等[27]则利用纤维素酶消化洗脱法为强奸案中物证的提取提供了良好的途径。也有学者通过测定受害者体内精液和前列腺液中酸性磷酸酶活性的变化规律，为性侵案件的作案时间提供了良好的线索[28]。

5 种属鉴别

早在1994年，学者们就开展了利用酶鉴定昆虫种属及其分类的研究。2009年Park等[29]利用DNA细胞色素酶2～6区序列研究及分类排序成功鉴别韩国Calliphorinae丽蝇亚科的种属。王新杰等[30]则利用聚合酶链反应、电泳等技术对中国的嗜尸性蝇类线粒体编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因进行测序分析，认为该序列分析可作为法医学嗜尸性蝇类种属鉴别的可靠方法。此外，刘牧等[31]应用红细胞酸性磷酸酶、腺苷脱氨酶、腺苷酸激酶同步电泳分型，从血型遗传学角度对汉族、蒙古族、鄂伦春族等7个族群血痕中三种酶的表型分布、基因频率进行了调查，并计算出识别能力，与白种人、黑种人比较差异有统计学意义。

6 展 望

鉴于酶的独有特性，法医工作者已经将其广泛应用于血型、血痕和精斑鉴定及人和昆虫物种鉴别等方面，而酶学检测在推断死因、分析致伤机制以及损伤和PMI的推断逐渐成为当今法医学研究的热点。今后，如何利用现有的各种检验技术，通过简单的实验操作进行活体、尸体以及现场血痕中酶活性、含量等随时间的动态演变规律进行综合分析，筛选有实用价值的检测指标，成为法医工作者今后的研究方向。

[1] Gos T,Raszeja S.Postmortem activity of lactate and malate dehydrogenase in human liver in relation to time after death[J].Int J Leg Med,1993,106(1):25-29.

[2] 金菊，李斌，焦白光，等.大鼠死后肝脏磷酸果糖激酶-2含量的变化[J].法医学杂志，2007，23(2)：84-85.

[3] 闫宜锋，李永宏.大鼠离体肝脏5′-NT和ACP活性与PMI的相关性研究[J].皖南医学院学报，2008，27(3)：170-171.

[4] Henke SE,Demarais S.Changes in vitreous humor associated with postmortem interval in rabbits[J].Am J Vet Res,1992,53(1):73-77.

[5] 李兴彪，张海燕，邵黎明.家兔急性胰腺炎死后不同时间眼玻璃体液淀粉酶变化[J].法医学杂志，2004，20(3)： 143-144.

[6] 王伟平，龙仁，刘承泉，等.家兔玻璃体液2种酶活性变化与死亡时间的相关性[J].中国法医学杂志，2005，20(4)： 199-201.

[7] Woertgen C,Rothoerl RD,Brawanski A.Neuron-specific enolase serum levels after controlled cortical impact injury in the rat[J].Neurotrauma,2001,18(5):569-573.

[8] 陈仁辉，李永宏，蔡红星，等.大鼠弥漫性脑损伤后早期病理学及烯醇化酶表达[J].中国法医学杂志，2005，20(5)：263-265.

[9] 焦炎，牛四平，李银琦，等.脑外伤者血浆NSE含量与损伤程度的相关性[J].中国法医学杂志，2010，25(2)：94-96.

[10] 杨静，王晔，陈晓刚，等.大鼠脑液压冲击伤caspase-8的表达[J].法医学杂志，2006，22(1)：1-3.

[11] 郭晓冲，李如波，梁红霞，等.大鼠脑挫伤后基质金属蛋白酶3的表达[J].法医学杂志，2009，25(1)：1-5.

[12] Harter L,Keel M,Hentze H,etal.Caspase-3 activityis present in cerebrospinal fluid from patientswith traumatic brain injury[J].J Neuroimmunol,2001,121(1/2):76-78.

[13] 蔡红星，李周儒，程言博，等.Caspase3和iNOS在人挫伤脑组织中的时序性表达[J].法医学杂志，2009，25(4)：241-245.

[14] 杜宇，官大威，赵锐.皮肤切创愈合中caspase-3表达的免疫组化研究[J].法医学杂志，2004，20(1)：1-3.

[15] 王起，官大威，赵锐，等.大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中caspase-3的表达及时间规律[J].法医学杂志，2008，24(1):5-7.

[16] Saatman KE,Abai B,Grosvenor A,etal.Traumatic axonal injury results in biphasic calpain activation and retrograde transport impairment in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(1):34-42.

[17] 甄博，吴旭，杨丽，等.大鼠局灶性脑损伤后calpain1和calpain2的表达[J].中国法医学杂志，2011，26(1)：13-15.

[18] Nakajima T,Hayakawa M,Yajima D,etal.Ti me-course changes in the expression of heme oxygenase-1 in human subcutaneous hemorrhage[J].Forensic Sci Int,2006,158(2-3):157-163.

[19] 余荣军，樊军，胡森杰，等.SD大鼠肢体挫伤后血清生化指标变化及其法医学意义[J].中国法医学杂志，2008，23(5)：293-295.

[20] 彭雪，靳占峰，邵洪江，等.急性心肌缺血猝死心肌中血红素加氧酶-1的表达[J].中国法医学杂志，2010，25(3)：162-165.

[21] 袁翔天，彭雪，靳占峰.急性心肌缺血猝死心肌中FAPα和TGF-β1的表达[J].法医学杂志，2012，28(1)：18-20.

[22] Ikegaya H,Iwase H,Hatanaka K,etal.Diagnosis of cyanide intoxication by measurement of cytochrome c oxidase activity[J].Toxicol Lett,2001,119(2):117-123.

[23] 步建衡，靳彦奎，谷建平.家兔非热低压电击伤血清LDH和HBDH活性的动态变化[J].中国法医学杂志，2009，24(2)：87-89.

[24] Nishio H,Takai S,Miyazaki M,etal.Usefulness of serummast cell-specific chmase levels for postmortem diagnosis of anaphylaxis[J].Int J LegalMed,2005,119(6):331-334.

[25] Horn KD,Halsey JF,Zumwalt RE.Utilization of serum tryptase and immunoglobulin e assay in the postmortem diagnosis of anaphylaxis[J].Am J Forensic Med Pathol,2004,25(1):37-43.

[26] Mayer DE,Krauskopf A,Hemmer W,etal.Usefulness of post mortem determination of serum tryptase,histamine and diamine oxidase in the diagnosis of fatal anaphylaxis[J].Forensic Sci Int Genet,2011,5(1):57-63.

[27] Voorhees JC,Ferrance JP,Landers JP.Enhanced elu-tion of sperm from cotton swabs via enzymatic digestion for rape kit analysis[J].J Forensic Sci,2006,51(3):574-579.

[28] Collins KA,Bennett AT.Persistence of spermatozoa and prostatic acid phosphatase in specimens from deceased indi viduals during varied postmortem intervals[J].Am J Forensic Med Pathol,2001,22(3):228-232.

[29] Park SH,Zhang Y,Piao H,etal.Sequences of the cytochrome C oxidase subunit I(COI) gene are suitable for species identification of Korean Calliphorinae flies of forensic importance[J].J Forensic Sci,2009,54(5):1131-1134.

[30] 王新杰，王学海，刁立江，等.潍坊地区六种常见嗜尸性蝇mtDNA COI区序列研究[J].法医学杂志，2006，22(2)：93-94.

[31] 刘牧，沈淑萍，谢立平，等.中国北方7个群体3种酶型的遗传多态性[J].中国法医学杂志，2000，15(4)：226-227.