Claudins蛋白在非小细胞肺癌中的研究进展

车娟娟(综述),曹邦伟(审校)

(首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科，北京 100050)

肺癌死亡率位居全世界恶性肿瘤的首位，其5年生存率仅为15%。其中，非小细胞肺癌占肺癌的75%。在治疗方式上，除了传统的手术、放疗和化疗外，近年来靶向治疗的出现在一定程度上为其预后带来了新的希望，但是尽管如此，肿瘤复发、转移仍是无法攻克的难题。并且即便早期手术切除的患者仍会发生复发和转移，非小细胞肺癌浸润、复发和转移的相关机制已成为目前研究的热点。Claudins蛋白家族是紧密连接(tight junction,TJ) 的主要组成部分，首先在1998年由Furuse等[1]发现，其参与调节细胞的通透性、极性以及细胞的分化和增殖，并且和疾病的免疫防御密切相关。Claudins蛋白家族表达异常与恶性肿瘤的复发、转移及预后相关。可能作为NSCLC诊断、治疗及预后判断的分子标志。

1 Claudins蛋白的分布、结构及功能

Claudins家族包括23个成员，相对分子质量约22×103，聚合于细胞质膜上构成TJ复合物的主链。Claudins蛋白分布于皮肤、脑、神经系统、内脏组织中，其在组织中表达分布具有一定的特异性，大部分组织中表达两种以上Claudins，如Claudin4和Claudin8存在于肾脏中，而Claudin1、Claudin2及Claudin3共同存在于肝脏中，也有一些组织紧密连接链中的Claudins是特定的，少突胶质细胞的髓磷脂、睾丸的足突细胞中主要表达的是Claudin11。

Claudins家族成员具有相同的结构，其肽链4次穿越细胞膜，N末端和C末端位于细胞内部，C末端在信号转导中发挥重要的作用，其上存在结合域，可与内层的蛋白，如闭锁小带1和闭锁小带2等分子连接；细胞外的肽链形成两个跨膜环，这两个环可以与邻近其他细胞的同种类型的环相接触，也可以和一些不明确的分子相接触，通过同源性或异源性接触调节细胞连接处的选择渗透性。其中Claudins的第一个细胞外环决定细胞间的跨上皮电荷抵抗和细胞外电荷的选择性。

2 Claudins蛋白的调节途径

肌动蛋白和肌球蛋白是多种信号分子参与TJ调节的两个共同的作用靶位点：肌球蛋白与肌动蛋白相连并定位于从底部到顶点的连接复合物，肌球蛋白结构收缩可以对紧密连接膜产生离心性牵引，进而调节TJ的渗透性。Claudins对细胞连接处选择渗透性的调节主要通过蛋白激酶途径实现，蛋白激酶A或蛋白激酶C作用于Claudins上特定氨基酸靶点，一般以丝氨酸、苏氨酸为主。Claudins磷酸化后，TJ功能下降，表现为氯化物渗透性增加。其可能原因是磷酸化的Claudins干扰TJ的形成[2]。不同蛋白激酶作用于不同的Claudins分子，在研究卵巢癌Claudins的调节机制时发现，当蛋白激酶A和蛋白激酶C激活后，它们作用在不同的靶蛋白：蛋白激酶A作用于Claudins上C末端第192位氨基酸，而蛋白激酶C使Claudins磷酸化[3]。

3 Claudins组成的TJ结构和功能

Claudins蛋白与咬合蛋白和连接黏附分子等共同组成TJ，其中Claudins蛋白是TJ的主要成分，构成了TJ的骨架[4]。TJ又称闭锁小带，是位于细胞侧膜最顶端的一组连续网结状的条索，它与黏附连接和桥粒共同组成了TJ复合体。TJ通常位于上皮顶端两相邻细胞间,在紧密连接处的细胞质膜几乎融合并紧紧结合在一起。从结构上看,相邻两细胞间的TJ是靠紧密蛋白颗粒重复形成的一排排的条索将两相邻细胞连接起来,这些蛋白质颗粒的直径只有几个纳米，它们形成连续的纤维,就像焊接线一样，将相邻细胞间连接起来,并封闭了细胞间的空隙。TJ除了有加强细胞间连接的机械作用外，在控制细胞间离子流和维护组织内稳态上也起重要作用，这就是TJ的屏障功能,如血脑屏障，即脑血管内皮细胞的紧密连接形成密集的屏障，以阻止血液与脑细胞外液相混，以及肾小球中参与构成血尿屏障等。TJ像栅栏一样连续地环绕细胞顶端，阻止上皮细胞顶侧膜和基底外侧膜中不同分子的相互混杂，这种功能被称为栅栏功能。若栅栏功能被破坏，将导致细胞极性丢失。此外，TJ在信号转导上也起了重要作用。

4 Claudins蛋白与非小细胞肺癌

目前关于Claudins蛋白所构成的TJ成为大家关注的热点，认为其在肿瘤细胞的浸润、形态转化、运输、最终出现转移等过程中扮演重要的角色。在非小细胞肺癌中也有一些探讨机制的研究，而且不同的家族成员作用也不尽相同。

4.1Claudin1与非小细胞肺癌 Claudin1最早是在1998年由Furuse等[1]首先发现的，因此研究较多。Chao等[5]研究发现，64例肺腺癌患者中，Claudin1 mRNA低表达患者总生存期短，通过对另外67例腺癌患者肿瘤标本进行免疫组织化学检测，也证实Claudin1 mRNA低表达患者总生存期短。进一步通过时间推移成像证实，Claudin1高表达能够抑制肿瘤细胞离散，抑制肿瘤细胞迁移、侵袭和转移。在将Claudin1基因剔除后，证实肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强。该研究还发现，Claudin1一方面能够增加肿瘤侵袭转移抑制因子的表达，如连接组织生长因子、凝血酶敏感素1、肝癌缺失基因1、咬合蛋白,闭锁小带1；另一方面，它能抑制侵袭转移强化因子的表达，如分泌磷酸蛋白1、切像同源盒1、转化生长因子α、胎盘生长因子等。因此，Chao等[5]认为，Claudin1是肺癌侵袭转移的抑制因子，能够预测预后，并可能成为肺腺癌潜在的治疗靶点。Dukes等[6]研究发现，抑制内吞体分选转运复合体功能后，TJ蛋白Claudin1堆积在诸如肺、肾等上皮细胞内的小囊泡内，从而导致上皮细胞极性改变，参与到肿瘤细胞的迁移转移过程中。

Merikallio等[7]则在肺癌细胞系中研究了吸烟对肺腺癌Claudin1表达状况的影响，发现吸烟者甚至戒烟者与非吸烟者相比，Claudin1的阳性率明显增高；在鳞癌患者中，吸烟指数高者与吸烟较少者及非吸烟者相比，Claudin1的表达明显增高；该研究显示，无论是鳞癌还是腺癌患者，Claudin1高表达的患者生存更佳。Jung等[8]研究证实，与腺癌相比，在鳞癌中Claudin1的表达更强，而Claudin4和Claudin5在腺癌的表达更强。鉴于不同Claudins蛋白家族成员在不同病理类型肿瘤存在表达差异，可能会为不同的肿瘤类型寻找作用靶点。

4.2Claudin2与非小细胞肺癌 Claudin2也是学者关注的热点之一，但是其在肺癌肿瘤细胞转移中的作用机制还在研究中。Ikari等[9]采用实时反转录-聚合酶链反应及Western blotting检测Claudin2蛋白在肺癌细胞系的表达状况，利用划痕愈合实验检测细胞的迁移能力。结果发现，Claudin2的表达在A549细胞系中高于正常肺组织。Claudin2的剔除并不影响其他连接蛋白的表达，如Claudin1、咬合蛋白及上皮钙黏素，同时核内的c-Fos、c-Jun及核因子κB的表达也未改变，但Sp1在核内的表达水平下降，而其剔除后降低细胞迁移能力，伴随着基质金属蛋白酶9的表达降低和酶活性下降，认为Claudin2通过增加基质金属蛋白酶9的表达及酶活性的提高，进而使基质金属蛋白酶9介导的Sp1在核内分布提高，最终上调A529细胞的迁移能力。该研究证实，Claudin2在肺腺癌细胞的迁移中发挥重要作用，进而影响着肿瘤细胞的转移进程。

表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)作为目前研究最热的靶点，也与Claudins蛋白家族存在联系。Peter等[10]研究EGFR与Claudin2的关系，发现肺A549细胞系拥有功能性的TJ，并且表皮生长因子治疗使Claudin2的表达增长了46%；EGFR信号降低了胆碱的单层渗透性，触发了细胞的重构。该项研究认为，EGFR信号通路在A549细胞生理方面扮演重要角色，并且协同Claudin2加速肿瘤细胞定植。因此探讨表皮生长因子及Claudin2对A549细胞渗透性及重组的影响能够帮助解释NSCLC细胞的定植并且有助于研究发现新的抗肿瘤治疗方法。

4.3Claudin3与非小细胞肺癌 Jung等[8]通过免疫组织化学法回顾性分析14例肺组织及171例非小细胞肺癌标本中Claudin3的表达，发现正常肺上皮细胞均有表达，而在171例肺癌标本中，45.6%出现表达，其中在鳞癌的表达率为50%，腺癌为41.6%，两种不同病理类型中表达并无统计学差异；分析与预后的关系，认为Claudin3不能作为预后分子标志物。而Moldvay等[11]的研究结果显示，Claudin3的表达在不同病理类型间明显不同。在鳞癌和腺癌中表达存在统计学差异，在腺癌与类癌中表达也存在差异，同时在鳞癌和小细胞癌中也存在表达差异，但是对其预后的意义尚不明确。

还有研究发现，Claudin3是产气荚膜梭状芽孢杆菌内毒素的天然受体，两者结合后能够导致细胞快速溶解[12]。也有研究显示，产气荚膜梭状芽孢杆菌内毒素能够有效地抑制Claudin3表达的恶性肿瘤，由此Claudin3将可能作为肿瘤治疗的潜在靶点[13]。

4.4Claudin4与非小细胞肺癌 Lonardi等[14]试图通过使用Claudin4的特异性抗体在浆膜腔积液中检测转移肿瘤细胞存在来判断Claudin4的临床意义，该研究对345例包括胸膜、腹膜及心包的积液进行染色，结果显示230例不同来源的上皮转移患者中，228例抗Claudin4强阳性表达，与此同时，活动期胸膜炎以及恶性胸膜间皮瘤均为阴性表达。另外，该研究还显示Claudin4能在严重炎性反应背景下检测出单个肿瘤细胞的存在。Facchetti等[15]的研究也显示，在浆膜腔积液中，62例肿瘤转移细胞中60例Claudin4高表达，而在间皮细胞中全部为阴性。鉴于其有高度的敏感性和特异性，Claudin4可能成为鉴别浆膜腔积液转移上皮细胞的理想的单一标志物。

另外，Merikallio等[7]在肺癌细胞系中研究了吸烟对肺腺癌Claudin4表达状况的影响，发现吸烟者甚至戒烟者与非吸烟者相比，同Claudin1一致，Claudin4的阳性率也明显增高，差异有统计学意义。在鳞癌患者中，吸烟指数高者与吸烟较少者及非吸烟者相比，Claudin4的表达也明显增高。与Claudin1不同之处在于，只有腺癌高表达Claudin4的患者生存更佳，鳞癌则不佳。

4.5Claudin7与非小细胞肺癌 Lu等[16]主要研究Claudin7，发现其在支气管上皮细胞正常表达，而在肺癌细胞中下调或断裂。为验证Claudin7的功能，Lu等[16]将Claudin7的cDNA转染至无Claudin7表达的肺癌细胞系NCI-H1299中，发现该细胞对于肝细胞生长因子的治疗应答降低，表现为能动性下降，且比正常细胞形成的足突明显减少。另外，此类细胞在肝细胞生长因子治疗后侵袭能力急剧降低。该研究还证实，与对照组细胞相比，转染Claudin7的细胞外信号调节激酶1/2磷酸化水平显著降低，提示Claudin7抑制侵袭功能可能是通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路实现的，之后的实验也证明了这一点。

关于表达，Li等[17]的研究证实，Claudin7在肺鳞癌及腺癌组织中明显下降，而且其表达水平与肿瘤的分化程度及淋巴结转移存在相关性。Merikallio等[7]在肺癌细胞系中也研究了吸烟对肺腺癌Claudin7表达状况的影响，在鳞癌患者中，吸烟指数高者与吸烟较少者及非吸烟者相比，Claudin7的表达显著增高，而且高表达Claudin7的鳞癌患者生存更佳。

4.6Claudin18与非小细胞肺癌 Niimi等[18]首先证实，Claudin18可能在肺及胃肠的细胞TJ中发挥重要作用。Merikallio等[19]分析Claudin18与Claudin10在原发性肺癌的表达，结果显示12.7%(34/268)的患者表达Claudin18，而Claudin10的表达则为12.5%(34/271)，且两者的表达明显相关；两者的表达主要存在于肺腺癌，阳性率分别为21.2%(23/108)和23.4%(26/111)，女性患者两者多高表达，有趣的是，两者的表达更多见于非吸烟者；进行预后分析发现，在腺癌中Claudin18高表达提示预后获益，是独立的预后因素，可能成为肺腺癌的预后标志物。另外也有学者发现，Claudin18可能也参与肺转移的过程[20]。甚至有研究证实，Claudin18可能作为肺小细胞肺癌治疗的靶点[21]。

5 结 语

由于Claudins蛋白家族在肿瘤中的特异性表达，使其可能成为不同肿瘤(包括肺癌)的分子标志物，用于不同病理类型肿瘤的鉴别；另外，个别成员也可能成为预测肺癌预后的标志物。从功能上来讲，Claudins蛋白家族多个成员参与了肺癌的转移，涉及不同的信号通路，这可能为将来肺癌的靶向治疗提供更多的靶点。相信Claudins蛋白家族能够在肺癌的检测、预后判断甚至靶向治疗方面发挥积极的作用。

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