激光扫描共聚焦显微镜技术原理及在脑血管疾病实验研究中应用＊

俞丽华 王 键 吕 磊 胡建鹏 陈业农

安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽省合肥市 230038

脑血管疾病是各种病因使供应脑部血液的血管发生病变所致的脑部病变，因其高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率严重危害人类的健康，我国第三次流行病学调查显示该疾病已成为我国第一位死亡原因［1］。由于它危害性高，医学界在研究其致病机理和寻找有效的防治药物付出巨大努力。医学界为研究脑血管疾病的致病机理和有效的治疗手段付出巨大努力。随着高科技的发展，激光扫描共聚焦显微镜（Laster scaning microscope，LSCM）技术出现为脑血管疾病病理病机探讨和中药如何发挥疗效提供解决这些问题的良好契机。

1 LSCM 的基本原理［2～4］

1.1 LSCM的基本结构 光学装置、激光光源、扫描装置、荧光显微镜、计算机处理和控制系统五部分组成。

1.2 光源更新和共聚焦技术应用 普通光学显微镜用的是场光源，标本每一点图像都受到邻近点衍射光或散射光的干扰。而激光共聚焦显微镜利用激光做光源，激光光源单色性很好，光源波长相同，这样从源头上消除了色差。物镜的焦平面有一小孔的挡板，可将焦平面以外的杂光挡住。这样又进一步消除了色差。

1.3 点扫描与成像技术的应用 将标本分解成二维或三维空间上无数个点，用激光束逐层逐点扫描成像，便将断层图像和三维重建图像有机结合，能提供细胞内部结构的厚、长、宽、断层面积和细胞体积等相关参数，给人以三维立体的概念然后通过计算机组成一个立体成像。最后用计算机进行采集和处理经光电倍增管放大的光信号。在载物台上加一个微量步进马达，最小步进距离为0.1μm，细胞和组织的各断层图像都可清晰显示，具有细胞“CT”的功能。

2 在脑血管疾病实验研究中激光扫描共聚焦显微镜的运用

2.1 形态学变化 LSCM用检测孔与照明针共轭成像，对组织各层细胞分别成像，并对活体细胞进行无损伤断层扫描，有类似CT的功能，故有显微“CT”的称号。因此，LSCM在组织细胞内部三维立体结构的形态观察有非常独到的优势。赵敏［5］根据LSCM的成像原理及激光观察大鼠脑缺血大鼠小胶质细胞的变化，用lectin荧光标记小胶质细胞，观察缺血中央区域、缺血半暗带和正常组织中小胶质细胞的变化。发现在缺血中央区域可见大量坏死细胞，正常组织和假手术组中有细胞体积小，呈分支状的小胶质细胞，在缺血半暗带则看见大量胞体增大，突起消失呈“阿米巴样”的细胞，为激活状态的小胶质细胞。韩冬［6，7］用LSCM技术研究观察缝隙连接对大鼠脑缺血再灌注后血脑屏障通透性变化和缺血区不同部位缝隙连接分布情况，研究发现脑缺血再灌注后缝隙连接在半暗带区进行再分布，缝隙连接斑比以前更大的，来加强细胞间信号传递及细胞间物质交换。周琴［8］用大鼠脑局灶性缺血再灌注模型，用LSCM观察缺血7d后脑微血管直径和脑血管形态变化，研究发现阿魏酸钠能加快脑缺血后神经功能恢复，并可以减轻脑水肿，减小梗死体积，它的机制可能是促进血管生成有关。阿魏酸为川芎、当归单体的有效成分，这一研究表明川芎、当归有治疗脑血管疾病的作用。另外，庄明华等［9，10］运用LSCM观察活体家兔正常状态下大脑皮质内循环及动静脉形态上的比较，结果观察到血流速度、白细胞贴壁、血管口径、吻合通路、红细胞运动等现象变化。

2.2 脑神经细胞内Ca2＋测定 细胞内Ca2＋作为膜稳定剂、第二信使和代谢调节因子，它在机体的机能活动中有着重要作用，它可介导多种病理细胞死亡。近来在脑缺血的研究中，神经细胞Ca2＋超载是脑缺血损伤的重要机制，在脑缺血缺氧疾病演变过程中，Ca2＋在神经胶质细胞和神经元细胞内积聚是导致细胞死亡的共同途径。众多学者已经利用LSCM检测Ca2＋浓度和分布情况。马玉侠等［11］采用荧光双标技术并结合LSCM对大鼠海马CA1区活体脑片进行观察，用LSCM对脑片细胞内Ca2＋荧光强度的测定。实验采用侧脑室定位注射L型钙离子通道阻断剂（Nitrendpine）及针刺脑缺血／再灌注大鼠海马CA1区神经元细胞内Ca2＋含量的影响。结果发现侧脑室定位注射L型钙离子通道阻断剂对脑缺血／再灌注大鼠海马有明显抑制作用，针药组比模型组Ca2＋显著降低，针刺组对Ca2＋升高的抑制作用优于单纯阻断L型钙离子通道阻断剂的功能。该实验表明针刺治疗可能阻断L电压门控型钙离子通道，参与钙稳态，抑制钙超载进而拮抗脑缺血损伤。杨沙等［12］对荧光探针Fluo－3／AM 负载的活体脑片用LSCM进行观察，比较发现大鼠海马CA1区锥体细胞Ca2＋不同时间点的变化，结果发现大鼠海马神经细胞Ca2＋随着缺血时间延长而升高，表明Ca2＋超载，提示脑缺血针刺治疗越早越好。刘治军［13］用LSCM研究发现二苯乙烯苷能抑制鼠类脑缺血再灌注所引起脑组织N－甲基－D天冬氨酸受体结合力和神经细胞内的钙离子浓度升高，减轻由钙超载导致的脑组织损伤，发挥脑保护作用。徐海伟［14］用LSCM实验研究技术结果发现褪黑素使叠氮钠所导致的海马锥细胞在超载状态中，而且钙离子浓度显著下降，并存在一定的量效关系。李秀华等［15］用LSCM技术观察大鼠短暂性脑缺血海马细胞内Ca2＋浓度荧光像素值的变化，发现异丙酚与依托咪酯在处理大鼠短暂性脑缺血损伤保护作用与降低海马细胞内 Ca2＋浓度关系密切。严灿等［16］运用LSCM技术测量到在PC12细胞损伤模型中Ca2＋浓度，研究加味四逆散对谷氨酸和皮质酮两者所导致的损伤PC12细胞中游离Ca2＋浓度的变化，结果发现治疗组血清能显著降低致损伤的PC12细胞内Ca2＋浓度，从而降低钙离子浓度，减轻Ca2＋超载对脑血管的损伤，发挥脑血管保护作用。

3 小结

激光扫描共聚焦显微技术在脑血管疾病病理机制实验研究和治疗脑血管疾病中药药物实验研究中发挥重要作用，其应用主要集中在细胞形态学观察、细胞骨架、细胞间通讯、细胞凋亡、细胞内钙离子浓度动态测定，以及对脑部微循环和细胞亚结构观察。目前国内外学者已经将它运用到脑血管疾病的多种因素研究中去，如对活细胞中NO进行实时、高灵敏的荧光探针、DNA在凋亡中变化、连续成像分析等等。总而言之，LSCM由于它的三维立体成像技术和动态测定、定时、定量等技术上具有独到的优势，它将被越来越广的认识和应用，并且随着LSCM技术的日益发展和完善，该项技术在脑血管疾病的机理研究和治疗靶点研究方面将具有更大发展空间。激光扫描共聚焦显微技术在中药方面研究还比较局限，目前在中药研究方面主要集中在单体、有效部位及复方的研究，在中药药理及细胞药物动力学等方面运用激光扫描共聚焦显微有广泛的前景。随着愈来愈多中药药理和中医针灸机理研究深入，脑血管疾病的治疗也将会取得更大的发展空间。

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