三个封闭群实验兔线粒体DNA D-loop区多态性分析

申幸娇, 岳秉飞, 马丽颖

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

三个封闭群实验兔线粒体DNA D-loop区多态性分析

申幸娇, 岳秉飞, 马丽颖

(中国食品药品检定研究院, 北京 100050)

目的 通过对三个封闭群实验兔线粒体DNA控制区序列进行分析，从分子水平探讨其群体的多样性和均一性。方法 利用特异引物对新西兰白兔、日本大耳白兔、青紫蓝兔三个封闭群共71份血液样品线粒体D-loop区部分序列进行扩增，纯化，测序，用Mega4.0和DNA SP软件对变异位点数、简约信息位点数、单倍型、单倍型多样度、核苷酸多样度等遗传信息进行分析。结果 在71份样品中，共检测出了6个多态性位点，多为C→G突变，定义了9种单倍型，且三个种群分别有各自单倍型，互不重叠。三个种群D-loop区多态性及种群多样性均偏低。结论 本研究为兔线粒体D-Loop区序列特征和国内常用三个封闭群实验兔种群结构提供了更多数据，并为遗传育种提供指导。

封闭群兔; 线粒体DNA; 单倍型; 多态性

实验兔是重要的实验动物之一，目前我国常规使用的实验兔有新西兰白兔、日本大耳白兔和青紫蓝兔等品种。相较于实验用大、小鼠，国内实验兔遗传质量尚不稳定, 遗传背景不甚明确, 遗传检测方法有待建立。线粒体DNA (mtDNA)是动物细胞核外唯一的DNA，以母系方式遗传。与核基因组相比，m tDNA分子量小、缺乏组蛋白保护、且缺乏损伤修复系统, 对外来物十分敏感，导致m tDNA在物种进化上的特殊地位。大量的突变位点以母系遗传的的方式保留下来, 形成了不同种间和种内的DNA多态性。特别是其DNA控制区(D-loop区), 已成为研究物种进化关系和遗传多样性极其有效的分子标记[1]。

1990年代，哺乳动物线粒体基因结构及功能研究逐渐展开[2～5]。多集中在对线粒体个别基因多态性分析，探究家兔种群多样性及分子进化关系。与此同时，对线粒体非编码区基因D-loop区重复单位有了进一步研究，并推测兔科线粒体D-loop区153 bp长串联重复单元的数目遗传特性可能由稳定选择所控制[6]。编码区及非编码区基因结构得到进一步详细阐明，线粒体全序列特征有了较为全面的描述[7]。但对家兔线粒体DNA研究相对偏少，王东卫等[8]用限制性酶切的方法研究了实验兔线粒体DNA遗传多样性，张亚萍等[9]通过对国内外兔线粒体D-loop区部分序列测序分析，证明中国白兔遗传多样性低，且所谓的中国白兔来源于欧洲。目前尚无利用线粒体D-Loop直接测序法对国内实验兔遗传多样性分析的报道，本研究以现用三个不同封闭群实验兔(新西兰白兔，大耳白兔，青紫蓝兔) 71个个体为研究对象，采用第一代测序技术测定了部分DNA控制区序列，通过多序列比对，分析了D-Loop区多态性，并进而检测了实验兔三个封闭群种内和种间的遗传多样性。作者开展此项研究，一为家兔线粒体D-Loop区序列特征提供更多数据，二以D-loop区为背景对国内常用实验兔三个封闭群种群结构进行了初步的判定。以期为实验兔遗传育种提供指导，并为实验兔遗传质量控制提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 样本

三个封闭群实验兔共71个样本，雌雄不限。具体来源及数量见表1。

耳缘动脉采血2m l，EDTA抗凝，血样放于4℃保存，3 d内提取全基因组DNA。

1.2 试剂及设备

主要试剂: NaI分析纯购于Amresco公司; 普通Taq酶，dNTP M ixture、DL2000 DNA Marker均购于Takara公司; 2×PCR Master M ix购于全新拓达科技有限公司。

主要设备: MyCyclerTM PCR仪(Bio-Rad公司),核酸琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司), 台式冷冻离心机(Hetttich M IKRO 22R), 紫外图像分析仪(上海复日)。

1.3 基因组DNA提取

参照《分子克隆实验指南》[10]及Loparev 等[11]方案，Na I法提取抗凝血基因组DNA。

1.4 PCR扩增

参照NCBI欧洲兔线粒体全序列设计引物。欧洲兔线粒体DNA在 G eneBan k中序列号为AJ001588，记录全长17 245 bp，其中目的片段D-Loop区域为: 15 446～17 245，共1 800 bp。利用Primer 5 软件, 对目的序列分两段设计两对特异引物。引物由上海生工生物有限公司合成(表2)。反应总体系为25 μl, 上游引物F和下游引物R各(10 μmol/L) 0.5 μl, 模板DNA(10～50 ng) 1 μl，2× PCR Master M ix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl。反应条件为95℃预变性4 min; 然后94℃变性30 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸1 min, 35个循环; 最后72℃延伸7 min; 4℃保存。

1.5 电泳鉴定及PCR产物直接测序

用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，参照DNA marker DL2000，判定分子量大小，最后测序鉴定，与GenBank中欧洲兔线粒体序列比对。测序由中美泰和生物技术公司完成。

1.6 数据分析

使用DNAbaser软件对测序序列进行人工校准和序列拼接; Clustalx软件再次辅助校对并进行序列比对，生成所需要文件格式; 使用MEGA4.0软件及DNA SP(Version 4.10.8)软件对三个种群进行分子遗传分析: 变异位点数(Variation sites)、简约信息位点数(Parsimony informative sites)、核苷酸多样度(Nucleotide diversity, Pi)、平均核苷酸差异(Average No. of nucleotide differences, K)、单倍型数(Haplotypes, h)、单倍型多样度(Haplotype diversity, Hd)，核苷酸歧义度(nucleotide divergence)。

表1 实验兔名称、采样地、数量、代号Table 1 Name, collecting location, quantity and code of rabbit species

表2 欧洲兔线粒体D-Loop区引物信息Table 2 The primer in formation of m tDNA D- loop in Oryctolagus cuniculus

2 结果

2.1 线粒体D-Loop区目的片段扩增结果详见图1。

2.2 三种封闭群实验兔线粒体D-Loop区序列特征

利用BLAST和GenBank中的欧洲兔线粒体序列进行比较, 相同区段一致性达到99.5%以上, 说明该序列即为目的序列。欧洲兔线粒体全长17 245 bp,其中目的片段D-Loop区域碱基位置为15 446～17 245,共1 800 bp。由于一代测序的局限性, 区间16 224～16 512共289 bp短串联重复区(CACCCGTACG CACGCACGTA 20 bp)重复个数不能准确测定。故在序列比对分析中舍弃此段序列。通过序列修正拼接，最终得到三种实验兔线粒体D-Loop区部分序列，长度是1 509 bp或1 662 bp。本次实验所有序列，与GenBank中的欧洲兔线粒体D-Loop区序列相比, 均在15 569位点处A碱基缺失, 16 574位点处C碱基缺失。此外，共发现6个变异位点。三个种群变异位点分布情况表3。

本研究检测71个个体，其中青紫蓝兔22只，新西兰白兔28只，日本大耳白兔21只。以Genbank中欧洲兔序列为参考，经DNA SP软件分析, 71条序列定义了9个不同的单倍型(Ⅰ-Ⅸ)，各单倍型在不同种群中的分布情况见表4。

从表中可以看出，9种单倍型分布在三种不同封闭群，且互不重叠。具体如下: 青紫蓝兔有4种单倍型，Ⅰ型为主要单倍型; 新西兰兔3种单倍型，Ⅶ型为主要单倍型，Ⅴ型个体也较多; 日本大耳白兔2种单倍型，Ⅷ为主要单倍型。

图1 线粒体D-Loop区分段扩增产物电泳结果(2%琼脂糖)Figure 1 The electrophoresis results of PCR amp lification of m tDNA D-Loop (2% agrose gel)

表3 三种封闭群兔线粒体DNA控制区变异位点Table 3 Variable sites of m tDNA control region of 3 groups of closed colony rabbits

DNA SP软件分析得到各群体内单倍型多样度和核苷酸多样度等信息(表5)。从该表中可以看出，目前国内常用三个封闭群实验兔单倍型多样度在0.095±0.084和0.532±0.083之间，新西兰白兔最高，日本大耳白兔最低; 核苷酸多样度均小于0.001; 平均核苷酸差异在0.190和1.341之间，新西兰白兔最大，日本大耳白兔最低; 变异位点数最多的是青紫蓝兔(5个)，其次是新西兰白兔(4个)。简约信息位点数最多是青紫蓝白兔(5个)，日本大耳白兔没有简约信息位点数。Tajima's D中性检验均不显著(P＞0.10)，符合中性突变。从以上信息来看，三个封闭群实验兔遗传多样性均在降低，尤其日本大耳白兔，21个样品中，其中20只实验兔具有相同单倍型体。

三个种群种内及种间歧异度见表6。从表中可以看出，种群内部歧异度介于0.013 % ～ 0.087%，均比较低，尤其日本大耳白兔，仅为0.013%。从这个角度, 依然可以看出, 三个封闭群线粒体D-Loop区核苷酸变异贫乏。

3 讨论

线粒体作为特殊的分子标记, 已经得到了较为广泛的应用。越来越多的物种通过对线粒体D-loop区序列分析来判定其遗传结构及种群亲缘关系[12～13]。其中不乏利用线粒体基因对封闭群动物遗传检测方面的研究[14～15]。文献报道[16]，欧洲兔m tDNA全长17245 bp, DNA 控制区全长约为1800 bp。其DNA控制区全长包括三个保守序列区(Conserved Sequence Blocks CSB), 在三个保守模块间有两个串联重复模块: 存在于CSB1和CSB2之间的重复单元为20 bp的短串联重复区(short repeat SR); CSB3和tRNA-Phe之间的重复单元为153bp的长串联重复区(Long Repeat LR)。

表4 9个单倍型在三个封闭群兔中的分布Table 4 Distribution of 9 hap lotypes in 3 groups of closed colony rabbits

表5 实验兔三个封闭群线粒体DNA控制区核苷酸序列多态性Table 5 Nucleotide polymorphism analysis of m tDNA control region in 3 groups of closed colony rabbits

表6 实验兔三个封闭群群内及群间D-loop序列歧异度Table 6 Interbreed nucleotide divergence estimated from m tDNA D-loop sequences and intrabreed values from D-loop in 3 groups of closed colony rabbits

在所有兔科动物中，短串联重复(SR)数量一般保持不变，而由于在LR中缺乏终止子，长串联重复区重复个数会增加，这是导致D-loop区长度多态性的重要原因。本研究中，参考序列为4重复LR区，但一般兔形目动物以5重复LR区占主导地位。Casane 等[6]认为，LR重复单元数量与核遗传背景有关，并受一定的稳定选择所控制，不遵从中性突变。本次实验中，青紫蓝兔22只全为5LR重复; 新西兰白兔5LR重复个体10只，4LR重复个体18只; 大耳白兔5LR重复个体20只，4LR重复个体1只。单从这一角度，并不能说明三个封闭群实验兔遗传背景的不同。综合考虑线粒体DLoop区其他位点变异，以及9种单倍型的分布，便可看出，三个封闭群实验兔有独特的单倍型: 青紫蓝兔单倍型包括Ⅰ(17)、Ⅱ(1)、Ⅲ(2)、Ⅳ(2);新西兰白兔单倍型包括Ⅴ(7)、Ⅵ(3)、Ⅶ(18); 日本大耳白兔单倍型包括Ⅷ(1)、Ⅸ（20）。表2结果表明，三个群体6个变异位点中其中有5个是发生在LR区同一位置，均为C→G突变或缺失。造成这一现象的机制尚不明确，有待进一步研究。

从群体多样性看，三个群体遗传多样性均很低，其中日本大耳白兔最低，21个个体中，20个个体为相同单倍型。表明其m tDNA群体分化程度相当低，在母系遗传上具有一致性，单倍型丰富度: 日本大耳白兔＜青紫蓝兔＜新西兰白兔。研究表明[9]D-Loop区靠近tRNA-Pro端近700 bp的序列(也就是本研究中XLT1段序列)，共发现19个变异位点，而本研究同一区段青紫蓝兔只检测到1个变异位点，日本大耳白兔和新西兰白兔没有变异位点。倪丽菊等[14]利用PCR-RFLP方法分析云南滇南小耳猪与广西巴马小型猪群m tDNA，未见片段多态性。管敏强[15]等在分析ICR封闭群小鼠时，同样发现，其线粒体D-Loop区序列完全一致，不具多态性。可以推断，封闭群动物经过人工定向培育，可能致使种群的多样性大大降低。提示封闭群动物培育中近交系数可能在升高。然而封闭群多样性的评价标准尚未建立，单一线粒体这一分子标记数据不够充分，但本研究针对三个封闭群实验兔线粒体D-loop区序列在中进行分析，为实验兔的遗传背景提供了更多的资料，结合其他的分子标记，如微卫星，有待进一步为封闭群实验兔遗传检测方法建立提供思路和理论依据。

[1] Larizza A, Pesole G, Reyes A, et al. Lineage specificity of the evolutionary dynam ics of the m tDNA D-loop region in rodents[J]. J Mol Evol, 2002, 54(2):145-155.

[2] Casane D, Dennebouy N, de Rochambeau H, et al. Genetic analysis of systematic m itochondrial heteroplasmy in rabbit [J]. Genetics, 1994, 138:47 l-480.

[3] Hardy C, Callou C, Vigne JD, et al. Rabbit mitochondrial DNA diversity from prehistoric to modern times[J]. J Mol Evol, 1995, 40:227-237.

[4] Susan J, Fuller, Peter B, et al. Lim ited genetic differentiation among w ild Oryctolagus cuniculus L. (rabbit) populations in arid eastern Australia [J].Heredity, 1996, 77:138-145.

[5] Matthee CA, Robinson TJ.M itochondrial DNA differentiation among geographical populations of Pronolagus rupestris, Sm ith’s red rock rabbit (M ammalia-Lagomorpha) [J]. Heredity, 1996, 76:514-23.

[6] Casane D, Dennebouy N, de Rochambeau H, et al. Nonneutral Evolution of Tandem Repeats in the M itochondrial DNA Control Region of Lagomorphs[J]. Mol Biol Evol, 1997, 14 (8):779-789.

[7] Gissi C, Gullberg A, Arnason U. The complete m itochondrial DNA sequence of the rabbit, Oryctolagus cuniculus[J]. Genom ics, 1998, 50:161-169.

[8] 王东卫, 刘伟. 实验兔线粒体DNA多态性研究[J]. 动物科学与动物医学, 1999, 16(4):3-5.

[9] Long JR, Qiu XP, Zeng FT, et al. Origin of rabbit (Oryctolagus cuniculus) in China_ evidence from m itochondrial DNA control region sequence analysis[J]. Anim Genet, 2003, 34: 82-87.

[10] Sambrook J, Russell DW. 分子克隆实验指南(第三版)[M].北京: 科学出版社, 2002.

[11] Loparev VN, Cartas MA, Monken CE, et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents[J]. J Virol Methods, 1991, 34(1): 105-112.

[12] 郭彦斌, 刘丑生, 王慧, 等. 利用m tDNA D-loop 区研究中国10 个绵羊品种的遗传多样性与起源[J]. 农业生物技术学报, 2012, 20(7): 799-806.

[13] 危金普, 潘学峰, 李红权, 等.单重复DNA序列在哺乳动物m tDNA D-loop区的分布及进化特征[J]. 遗传, 2011, 33(1): 67-74.

[14] 倪丽菊, 谢建云, 胡建华. 云南滇南小耳猪与广西巴马小型猪m tDNA D-Loop的初步研究[J]. 实验动物与比较医学, 2011, 31(03):207-210.

[15] 管敏强, 曹琼洁, 陈忠义, 等. 线粒体DNA序列分析封闭群小鼠遗传稳定性[J]. 实验动物与比较医学, 2009. 29(2): 113-115.

[16] M ignotte F, Gueride M, Cham pagne AM, et al. Direct repeats in the non-coding region of rabbit m itochondrial DNA: involvement in the generation of intra- and inter-individual heterogeneity[J]. Eur J Biochem, 1990, 194:561-571.

Analysis of the Polymorphism of Mitochondrial DNA Control Region in Three Closed Colonies of Rabbits

SHEN Xing-jiao, YUE Bing-fei, MA Li-ying
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo discuss the genetic diversity and uniformity in three groups of closed colony rabbits based on mitochondrial DNA control region.MethodsSeventy-one blood samples from New Zealand rabbit, Japanese White rabbit and Chinchilla rabbit were collected for amplifying ,purifying and sequencing the part of sequences of mitochondrial DNA control region by PCR and Genetic Analyzer. The variation sites, Parsimony informative sites, haplotypes, haplotype diversity, nucleotide diversity were analyzed by Mega 4.0 and DNA SP.Results6 diversity sites and 9 haplotypes were found in the seventy-one rabbits, and most mutations were C→G. Every population had its own haplotypes. The polymorphism of M itochondrial DNA Control Region and population diversity in three group were both low.ConclusionsMore sequence information about m tDNA sequences and population structure of laboratory rabbits were supplied,which was helpful to genetic breeding.

Closed colony rabbits; M itochondrial DNA ; Haplotype; Genetic polymorphism

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0029-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.006

2013-04-03

“国家科技支撑计划”(2011BAI15B 01; 2013BAK11B01)

申幸娇(1987-), 女, 硕士研究生, E-mail: xjshen816@163.com

岳秉飞, 研究方向: 实验动物遗传学, E-mail: yue-bingfei@nifdc.org.cn