白花蛇舌草对人骨肉瘤MG-63细胞Bax基因表达的影响＊

黄煜朗，唐毓金，△，王俊利，谢克恭，黄 可

（1.广西医科大学研究生学院，南宁530021；2.右江民族医学院附属医院脊柱骨病外科，广西百色；3.右江民族医学院附属医院检验科，广西百色533000）

骨肉瘤是儿童与青少年常见的起源于间叶组织的恶性肿瘤。随着化学治疗、手术及骨重建等治疗手段的发展，有资料研究显示目前5年总体生存率为55%～75%［1-2］，但仍是病死率极高的恶性肿瘤。因此，研究新的抗肿瘤药并应用于临床是提高骨肉瘤疗效的重要途径之一。本试验通过测定白花蛇舌草注射液对骨肉瘤MG-63 细胞Bax 基因表达的影响，为进一步开发白花蛇舌草抗骨肉瘤的药用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人骨肉瘤细胞株MG-63 细胞为广西医科大学科学实验中心惠赠，引自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药物与试剂 白花蛇舌草注射液购自安徽凤阳科苑药业有限公司（国药准字号Z34020595，批号120601）；MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。胎牛血清、高糖DMEM培养基购自Gibico 上海立菲生物技术有限公司；PBS（1 ×）、胰蛋白酶购自北京索莱宝公司；细胞培养瓶、96 孔板、15 m L 离心管购自Corning 公司；TRIzol 试剂购自Invitrogen公司；引物合成由宝生物工程（大连）有限公司完成；逆转录试剂盒购自TaKaRa 公司；MarkerⅠ、2 ×Taq PCR Master Mix（KT201-01）、SYBR GreenⅠ试剂盒购自TianGen 公司；8 联管购自美国Axygen 公司。

1.1.3 仪器CO2细胞培养箱MCO-18AIC、超低温冰箱MDF-U72V购自日本SANYO公司；生物安全柜BHC-1300ⅡA／B3 购自苏净集团安泰公司；电热恒温水槽DK-8D 型购自上海精宏实验设备有限公司；台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；酶标仪（Multiskan MK3 Thermo），PCR仪（BIO-RAD），倒置显微镜（Leica 型号DMIL）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人骨肉瘤MG-63 细胞接种于培养瓶，加入体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称培养基）5 m L，置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中常规培养，每2 d传代1 次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖抑制 取对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化后加培养基5 m L吹打成混悬液，计数后调整细胞浓度，取150μL（5 ×103个）接种于96 孔板。将白花蛇舌草注射液与培养基配制成50、100、200、300、400μL／m L不同浓度含药液，现配现用。待细胞贴壁后，弃去培养基，加入不同浓度的含药液，并设空白对照组（只加相同量培养基），每组5个复孔。培养24 h 后，加入20μL的5 mg／mL MTT，继续培养4 h 后弃去含药液，加入150μL DMSO，37 ℃恒温摇床震荡10 min，待结晶完全溶解后，在酶标仪上492 nm波长测定吸光度（A）值，取平均值，计算细胞抑制率。计算公式：细胞增殖抑制率（RI）＝（对照组A值-药物组A值）／对照组A值×100%。

1.2.3 Bax 基因表达

1.2.3.1 总RNA提取 取对数生长期细胞，调整为1 ×105个／mL，接种于培养瓶，待细胞贴壁后加100μL／mL含药培养基5 m L，分别培养6、12、24、48 h，按照Trizol 提取试剂说明书进行总RNA提取。紫外分光光度计测定总RNA浓度，取A260／A280在1.80～2.20 之间用于RT-PCR。

1.2.3.2 cDNA合成 参照逆转录试剂盒说明SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（RR820A），将RNA逆转录成cDNA。

1.2.3.3 RT-PCR检测 参照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047A）试剂盒说明。25.0μL 反应体系包括SYBR Permix Ex TaqⅡ12.5μL，上下游目的及内参（β-actin）引物（表1）各0.5μL，cDNA 1.0 μL，dd H2O 10.5μL。将25.0μL体系设3 个复孔，加入8 联管中，使用PCR仪进行扩增，95℃变性30s，95℃PCR反应5 s、63 ℃退火30 s，共计40 个循环的PCR反应，重复实验3 次。反应结束后得到扩增曲线和溶解曲线，计算2-△△Ct值。

表1 RT-PCR 引物

1.3 统计学处理 使用SPSS17.0 软件进行统计分析，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 白花蛇舌草注射液对MG-63 细胞增殖抑制作用MTT法检测结果示：（1）白花蛇舌草注射液对MG-63 细胞的抑制作用呈浓度依赖，当白花蛇舌草注射液浓度为200μL／m L、作用24 h 可见绝大部分细胞变圆、脱落、死亡。浓度在50μL／mL时抑制作用不明显（P＞0.05），而浓度为100μL／m L 时有明显的抑制作用（P＜0.05）。取浓度为100μL／m L进行下一步实验，见表2。（2）倒置显微镜下观察浓度为100μL／m L白花蛇舌草注射液对MG-63 细胞不同作用时间的细胞形态。空白对照组细胞狭长、形态多样，较紧密地贴壁生长，加药组（加药6 h组、12 h 组、24h 组及48h 组）细胞随着药物作用时间的延长，细胞逐渐皱缩、细胞间间隔变大，增殖被抑制，见图1。

2.2 Bax 基因的表达水平 RT-PCR 检测结果显示，Bax 基因溶解曲线无非特异扩增和引物二聚体，见单一峰，无杂峰，结果可信，见图2。取100μL／m L白花蛇舌草注射液分别作用于MG-63 细胞6、12、24、48h 后，Bax 基因表达水平明显高于空白对照组（P＜0.05），组间差别有统计学意义（P＜0.05），且呈时间依赖性，提示白花蛇舌草注射液抑制细胞增殖可能是通过上调Bax 基因表达而实现，见表3。

表2 不同浓度白花蛇舌草注射液对MG-63细胞的增殖抑制比较（±s）

表2 不同浓度白花蛇舌草注射液对MG-63细胞的增殖抑制比较（±s）

白花蛇舌草注射液浓度（μL／mL） 抑制率（%）005015．42±0．4310067．21±0．2720095．38±0．3130098．73±0．5640098．46±0．43

图1 倒置显微镜观察的结果（×200）

图2 RT-PCR 检测结果

表3 Bax基因的表达水平（±s）

表3 Bax基因的表达水平（±s）

组别 Bax基因空白对照组1．00±0．00加药6 h 组 5．39 ±0．388加药12 h 组 7．73 ±0．291加药24 h 组 16．91 ±0．414加药48 h 组23．42±0．335

3 讨 论

细胞凋亡是在凋亡信号作用下，由基因调控细胞主动死亡的过程，其形态主要表现为细胞固缩、染色质凝聚边集及形成凋亡小体［3］，现代研究认为肿瘤的药物治疗主要通过诱导细胞凋亡而达到治疗目的［4］。Bax 基因是属于Bcl-2 基因家族中调节细胞凋亡的促进基因，表达于多种肿瘤细胞中，其抗肿瘤的机制是通改变线粒体膜通透性，使细胞色素C及钙离子和小分子物质进入细胞质中，激活Caspase-3，使与细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活，导致细胞凋亡［5］。当Bax基因过度表达则形成Bax-Bax 二聚体，诱导细胞凋亡；而Bcl-2基因表达增高形成Bax-Bcl-2 二聚体时细胞凋亡被抑制，因此Bax 基因与Bcl-2 基因的比例在一定程度上决定着细胞是否凋亡［6］。中药提取物作为抗肿瘤药物是目前研究的热点，Mousavi 等［7］研究发现乳腺癌细胞在浓度为200～2000μg／m L的红花提取物中增殖受抑制，Bax 基因表达增高。Tsai 等［8］研究也表明，樟芝提取物可通过提高Bax 基因表达，降低Bc l-2 基因表达而达到诱导口腔癌细胞OCE-M1 和OC-2 凋亡。

白花蛇舌草属于茜草科草本植物的全草，具有清热解毒、活血散结、利水消肿的功效。近年来研究发现，白花蛇舌草的主要成分为蒽醌类、熊果酸、齐墩果酸、三萜类、多糖类、香豆素类及甾醇类等，具有抗菌、抗氧化、增强免疫功能，并通过调控Ras、C-myc、Bcl-2 等基因表达而具有不同的抗肿瘤作用［9-12］。白花蛇舌草注射液为中药白花蛇舌草提取制成的单味药灭菌水溶液。本实验发现浓度为100μL／m L 的白花蛇舌草注射液作用6 h 后，倒置显微镜观察可见MG-63 细胞逐渐皱缩变小、核深染，随着时间延长，细胞变圆、悬浮死亡，与Wilde 等［13］报道一致。PCR结果显示促凋亡的Bax 基因高表达，说明白花蛇舌草注射液对骨肉瘤MG-63 细胞具有抑制作用的机制可能是通过上调Bax 基因的表达来实现的。

综上所述，本实验立足于本地区丰富的中药资源，对白花蛇舌草作用于骨肉瘤细胞的机制进行部分研究，有利于白花蛇舌草的药用开发及研制抗骨肉瘤的新药提供实验依据。

［1］ Jaffe N.Osteosarcoma：review of the past，impact on the future.The American experience［J］.Cancer Treat Res，2009，152：239-262.

［2］ 张清，徐万鹏，郭卫，等.我国骨肉瘤治疗现状及改进建议——17 家骨肿瘤治疗中心1998～2008年资料分析［J］.中国骨肿瘤骨病，2009，8（3）：129-132.

［3］ Tamm I，Schriever F，Dcrken B.Apoptosis：implications of basic research for clinical oncology［J］.Lancet Oncol，2001，2（1）：33-42.

［4］ Sykiotis GP，Papavassiliou AG.Apoptosis：the suicide solution in cancer treatment and chemoprevention［J］.Expert Opin Investig Drugs，2006，15（6）：575-577.

［5］ Gottlieb RA.Mitochondria and apoptosis［J］.Biol Signals Recept，2001，10（3／4）：147-161.

［6］ Claassen MA，De Knegt RJ，Tilanus HW，et al.Abundant numbers of regulatory T cells localize to the liver of chronic hepatitis C infected patients and limit the extent of fibrosis［J］.J Hepatol，2010，52（3）：315-321.

［7］ Mousavi SH，Tavakkol-Afshari J，Brook A，et al.Role of caspases and Bax protein in saffron-induced apoptosis in MCF-7 cells［J］.Food Chem Toxicol，2009，47（8）：1909-1913.

［8］ Tsai WC，Rao YK，Lin SS，et al.Methylantcinate a induces tumor specific growth inhibition in oral cancer cells via bax-mediated mitochondrial apoptotic pathway［J］.Bioorg Med Chem Lett，2010，20（20）：6145-6148.

［9］ 刘盼盼，姚晓东，李洁.白花蛇舌草化学成分及其药理作用研究进展［J］.中国药业，2011，20（21）：96-98.

［10］ 沈楚云，林圣云，戴铁颖，等.白花蛇舌草诱导骨髓瘤8226 细胞凋亡的研究［J］.深圳中西医结合杂志，2012，22（1）：4-7，65.

［11］ Wang JH，Shu LH，Yang LL，et al.2-Hydroxy-3-methylanthraquinone from Hedyotis diffusa WILLD induces apoptosis via alteration of Fas／Fas L and activation of caspase-8 in human leukemic THP-1 cells［J］.Arch Med Res，2011，42（7）：577-583.

［12］ Lin J，Wei L，Xu W，et al.Effect of hedyotis diffusa willd extract on tumor angiogenesis［J］.Mol Med Rep，2011，4（6）：1283-1288.

［13］ Wilde A，Zheng Y.Ran out of the nucleus for apoptosis［J］.Nat Cell Biol，2009，11（1）：11-12.