沼泽红假单胞菌砷代谢基因多样性及进化分析

郭少伟，吕常江，2，张意，赵春贵

（1.华侨大学 化工学院，福建 厦门361021；2.浙江大学 化学工程与生物工程学系，浙江 杭州310027）

微生物在与砷的长期相互作用过程中进化出各种各样的砷代谢机制，在自身解毒过程中伴随着砷价态及形态的转化，对砷的地球化学循环起到了重要的影响［1］.近年来，微生物砷代谢研究发展迅速，先后报道了7种砷代谢机制［2］，包括细胞质As（Ⅴ）还原、呼吸性As（Ⅴ）还原、化能自养As（Ⅲ）氧化、化能异养型的As（Ⅲ）氧化、As（Ⅲ）甲基化、不产氧光合作用偶联的As（Ⅲ）氧化，以及As（Ⅴ）代替磷供细菌生长代谢，但研究证据并不支持最后一种砷代谢机制［3］.2004年，F.W.Larimer等［4］首次测定了沼泽红假单胞菌（R.palustris）［5］的CGA009菌株基因组序列；2006年，Qin等［6］从该菌株中克隆了转甲基酶基因（ars M），首次提供了细菌砷甲基化机制的实验证据.前期研究结果表明：R.palustris对砷具有较强的抗性，能够在厌氧条件下将胞内的As（Ⅴ）还原为As（Ⅲ）［7］.对已公布全基因组APB的砷代谢基因簇结构进行分析，R.palustris砷代谢基因簇具有更为复杂的“多操纵子”结构［8］.但关于不同砷抗性（ars）操纵子中砷代谢基因之间如何表达和调控，尚缺乏系统而深入的研究.本文以基因组砷代谢基因簇相关基因序列为基础，利用生物信息学手段，系统分析R.palustris砷代谢基因簇及砷代谢相关基因arsR，ars M和ArsC蛋白的系统进化关系.

1 材料与方法

1.1 基因组序列的获取和一般特征

分别从LPSN（http：∥www.bacterio.cict.fr／），IJSEM（http：∥ijs.sgmjournals.org／），ATCC（http：∥www.atcc.org／）和DSMZ（http：∥old.dsmz.de／index.htm）等网站获取目前已报道的R.palustris菌株.然后，在 NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）及 MicrobesOnline（http：∥microbesonline.org／）数据库以种名为关键词获取全基因组序列，描述R.palustris基因组的一般特征.

1.2 砷代谢相关基因及定位

在获取的全基因组序列中搜索目标基因，以报道的砷代谢相关基因为参照［1-2，9-11］，通过 GenBank注释获取相关基因的定位及功能，利用BLAST工具获取同源序列及基因注释；然后，结合获取基因序列的特征分析，确认基因功能注释的准确性.同时，利用EMBL（http：∥www.embl.org／）与 DDBJ（http：∥www.ddbj.nig.ac.jp／）数据库，对获取的基因信息进一步确定.

1.3 系统发育树的构建

用Clustal X 2.0软件对目的基因的核酸序列或蛋白的氨基酸序列比对分析，在Mega 5.0软件上用邻接法（neighbor joining，NJ）进行聚类分析.基于细菌全基因组序列的聚类分析参照文献［12］的方法进行，利用 Mauve 2.3.1软件获取基因组进化距离矩阵（genome content distance matrix），并在Mega 5.0软件上采用邻接法进行分析.

2 结果和分析

2.1 R.palustris基因组的多样性

从数据库中共收集到7株R.palustris的全基因组序列，其基因组一般特征如表1所示.从表1可知：7个菌株均含有1条染色体，GC摩尔分数为64%～66%，仅CGA009含有1个质粒；BisB5染色体相对较小，约为4.89 Mb，TIE-1染色体相对较大，约为5.74 Mb，其他5菌株染色体大小相近，约为5.5 Mb；DX-1含有105个假基因，远远高于其他菌株.此外，7个菌株含有的r RNA操纵元，r RNA及t RNA等数量上也存在一定的差异.CGA009砷代谢基因簇大小约为8.1 kb，明显高于其他菌株.结果表明：R.palustris基因组特征上呈现出多样性，R.palustris不同菌株具有高度异质化和多样化.

表1 R.palustris基因组一般特征Tab.1 General features of the genome of R.palustris

2.2 物种的进化关系和砷代谢基因簇结构分析

R.palustris菌株砷代谢相关基因的分布与结构，如图1所示.从图1可知：7个菌株的染色体中均含有以ars操纵子为主体的砷代谢基因簇，主要包括砷代谢调节基因（arsR）、细胞质As（Ⅴ）还原酶基因（arsC）、As（Ⅲ）外排蛋白基因（arsB或acr3p）、转甲基酶基因（ars M）、砷抗性相关功能基因（ars H）和未知功能基因（ars U）等.7个菌株中，ars操纵子主要包括arsRCC（acr3p）和arsRM两种类型.研究结果表明：R.palustris具有细胞质As（Ⅴ）还原代谢机制及As（Ⅲ）甲基化代谢机制.不同菌株的砷代谢基因簇由1至4个砷代谢操纵子组成，不同菌株基因簇中的基因组成、排列顺序和方向有所不同.

图1 R.palustris菌株砷代谢相关基因的分布与结构Fig.1 Distribution and structure of the arsenic metabolic genes in R.palustris

16S r RNA基因序列和基因组进化距离矩阵聚类分析及砷代谢基因簇结构的进化关系，如图1所示.基于16S r RNA基因序列的分析表明：Bis A53，BisB18和 DX-1聚为一类；TIE-1，CGA009，BisB5和Ha A2聚为一类.基因组进化距离矩阵聚类分析显示：BisB18和Bis A53聚为一类；Bis A53砷代谢基因簇在arsRCC（acr3p）基础上进化出了arsRUU，构成2个砷代谢操纵子；CGA009，TIE-1，DX-1，BisB5和Ha A2聚为一类.这5个菌株的特点是砷代谢基因簇更加复杂，而且均含arsRM.R.palustris不同菌株间存在着砷代谢基因的易位与倒位，不同菌株ars操纵子进化程度不同，进化趋向于结构更为复杂的“多操纵子”.两种聚类方式的结果虽然有差异，但基因组进化距离矩阵聚类分析分辨率更高，更容易分辨不同的菌株，同时与R.palustris菌株之间的砷代谢基因簇的进化关系［8］更相符.

图2 基于arsR基因序列的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic relationships based on arsR gene

2.3 砷代谢调节基因的分析

调节基因对基因的表达具有重要的调控作用.R.palustris菌株砷代谢基因簇中拥有多个操纵子，为了解不同操纵子中基因的表达关系，选择R.palustris，以及另外2种APB不同菌株的不同类型操纵子和4株非光合细菌arsRBC操纵子上游的arsR序列进行了系统发育分析，结果如图2所示.

从图2可知：不同操纵子中arsC，acr3p及ars M上游的arsR系统发育关系因种而异.以arsR（acr3p）C为例，在R.sphaeroides不同菌株中arsR同源性较高，而与R.vannielii的arsR的同源性较低.对arsRCC（acr3p）而言，在6株R.palustris中，Bis A53，CGA009，TIE-1，BisB5与BisB18的arsR同源性较高，而与DX-1相比，arsR同源性则较低.

arsRM操纵子上游的arsR也呈现出多样性.研究结果表明：同种不同菌株间相同（或相似）类型操纵子上游的arsR可以有较大差异，不同类型操纵子上游arsR的同源性也可很高.arsR的同源性差异可能与环境中砷调控基因的表达有关，但含有多个ars操纵子的细菌在砷代谢过程中，不同操纵子中砷代谢基因如何表达调控，其与菌种（株）抗砷能力之间的关系等问题目前尚不明确，还需要更多的证据.

2.4 细胞质砷还原蛋白分析

细胞质As（Ⅴ）还原酶基因（arsC）是ars操纵子的关键基因 .文献报道的典型菌种（株）和R.palustrisArsC序列的系统发育分析，如图3所示.由图3可知：5类不同的arsC表达产物中，现有的综述文献仅报道4类［13-14］.第Ⅰ类为ArsC以谷胱甘肽作为电子供体，第Ⅱ类为ArsC电子供体为硫氧还蛋白，第Ⅲ类命名为Arr2p，其电子供体与第一类相同，第Ⅳ类ArsC电子供体为mycothiol（MSH）.尤其是第Ⅴ类ArsC（syn ArsC），最先发现于集胞藻属（Synechocystissp.PCC6803）中，随后在其他淡水藻类中也发现了它的同源基因，其氨基酸序列与第Ⅱ类同源性较高，但电子供体却与第一类相同［15-16］.分析发现，该类ArsC首先与第Ⅳ类聚为一类，再和第Ⅱ类聚在一起.

已有文献认为，syn ArsC的变化机制是由ArsC催化位点上的半胱氨酸残基位置所决定的［17］，但其进化来源尚不清楚.通过数据库中n ArsC基因序列的同源性系统分析，尚未在其他细菌中发现该基因是否应单独列为一类，还值得探讨.同时发现：7株R.palustris均含有第Ⅰ类ArsC，而BisB5，CGA009，BisB18，Bis A53，TIE-1和DX-1还含有第Ⅱ类ArsC，这种同一基因组中含有两类arsC基因的现象明显区别于其他光合生物，在非光合生物中也不常见，显示出R.palustris砷代谢基因的多样性.

2.5 转甲基酶基因分析

图4 基于ars M基因序列的系统发育分析Fig.4 Phylogenetic relationships based on ars M gene

已有研究表明：转甲基酶（Ars M）可将细胞内的As（Ⅲ）转化为甲基砷化物，最终生成挥发性三甲基砷（TMA）排出胞外，降低了环境中砷的浓度，能够达到环境砷治理的目的［6］.因此，分析了R.palus-tris中ars M基因的多样性.与R.palustrisBisB5的ars M序列相比，5株R.palustris及8株典型非光合生物的ars M序列的同源性达80%以上，其系统发育分析如图4所示.从图4可知：CGA009，TIE-1，BisB5和 DX-1的ars M聚为一类，而Ha A2的ars M聚为另一类，表明ars M具有多样性.

3 讨论

基于已公布的全基因组序列砷代谢基因簇的分析，解析了R.palustris砷代谢机制和砷代谢基因簇.R.palustris砷代谢机制的主体为ars操纵子介导的细胞质As（Ⅴ）还原和As（Ⅲ）甲基化，菌株不同，砷代谢基因和砷代谢途径有明显差异.砷代谢基因簇的结构与分布呈现多样性，且不同菌株砷代谢基因簇进化程度不同，进化趋向于更为复杂的“多操纵子”结构.

调节基因在基因表达过程中发挥重要的作用，R.palustris砷代谢调节基因（arsR）具有多样性，同种不同菌株间相同（或相似）类型ars操纵子上游的arsR有较大差异，不同类型操纵子上游的arsR的同源性也可以很高.arsR的多样性可能与菌种（株）的环境适应性有重要的关系，尤其是含有多操纵子砷代谢基因簇中砷代谢基因的表达和调控，尚缺乏系统而深入的实验研究.

在同一基因组中含有两类arsC基因的现象并不常见.已有研究表明：一株放线菌谷氨酸棒状杆菌（ATCC 13032）中含有Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类ArsC［14］.本文的分析表明：7株R.palustris中均含有Ⅰ类ArsC，其中6个菌株同时含有Ⅰ和Ⅱ类ArsC.由此认为，这两类arsC能够同时表达，第Ⅱ类ArsC是第Ⅰ类ArsC功能上的补充，两类arsC同时表达更有利于细胞内物质的有效利用，并增强了细菌对砷的抗性.但究竟是否如此，两类ArsC在胞内如何协调发挥作用，尚缺乏实验证据.

As（Ⅲ）甲基化现象普遍存在于细菌、真菌、原生动物及高等动物中［18］.通过基因组砷代谢基因分析表明：R.palustris也普遍存在ars M，7株R.palustris中就有5株含有ars M，但不同菌株间，ars M同源性也具有较大差异.值得关注的是，有研究发现一些起始无甲基化现象的细菌，如Corynebacteriumsp，E.coli，Flavobacteriumsp，Proteussp和Pseudomonassp，在高浓度砷长期（6个月）诱导下，可将无机砷转化为甲基砷化物［18］.因此，细菌中arsM是来源于自身基因的演化，还是存在其他未发现的甲基化途径，也是值得探索的问题.

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