雪莲果叶中黄酮的提取工艺优化

陈红惠，刘 芳，沈清清

（1.文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663000；2. 文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663000）

雪莲果叶中黄酮的提取工艺优化

陈红惠1，刘 芳1，沈清清2

（1.文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663000；2. 文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663000）

为优化雪莲果叶黄酮的提取工艺条件，采用正交实验法，研究溶剂浓度、料液比、浸提温度和浸提时间4个因素对雪莲果叶黄酮提取量的影响。确定了雪莲果叶黄酮提取的最优条件为用体积浓度40%的乙醇，在料液比为1∶30(g/mL)的溶剂条件下在70 ℃提取1.5 h，提取2次，在此条件下黄酮含量提取量达到53.41 mg/g。通过工艺优化，雪莲果叶黄酮得率高，稳定性好。

雪莲果叶；黄酮；醇提法

黄酮类化合物（flavonoids）是自然界中植物的主要活性成分之一，其分布十分广泛，至今发现的黄酮类化合物已超过8000个[1]。黄酮类化合物具有抗病毒、祛痰平喘、防治心脑血管、抗氧化和抗肿瘤等功效，临床上用于治疗呼吸道疾病、心血管疾病等的药物多来源于黄酮类物质，此外其在保健品、食品和化妆品中都有广泛应用[2-3]。近年来，对黄酮化合物资源的开发与生物活性的相关研究越来越受重视。目前黄酮提取物主要的来源有大豆、银杏、荷叶等，对于雪莲果叶黄酮的研究尚未见报道。国内对于雪莲果的研究主要以化学成分分析及产品加工为主[4-6]，对于雪莲果叶中黄酮类物质的研究尚未见报道。将雪莲果种植过程中无用的茎叶进一步深开发能提高雪莲果产业的附加值，本试验采用乙醇回流提取法提取黄酮，通过正交试验对影响雪莲果叶黄酮的主要参数进行优化，以期为雪莲果叶黄酮的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

雪莲果叶：云南丽江，经低温烘干粉碎后待用。

芦丁标准品：北京生物制品检定所；NaNO2，NaOH，Al（N03）3， 95%乙醇，国产分析纯。

1.1.2 仪器

721可见分光光度计（郑州南北仪器设备有限公司），恒温水浴锅（常州诺基仪器有限公司），恒温干燥箱（河南同兴仪器设备有限公司），旋转蒸发仪（上海西域机电系统有限公司），分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

将新鲜雪莲果叶放入60 ℃干燥箱内烘干，取出后粉碎过筛，将不同粒度雪莲果叶粉储存于干燥棕色瓶中备用。

1.2.2 标准曲线的绘制

称取0.0216 g芦丁用50%的乙醇溶解，用容量瓶定容至100 mL，得到0.216 mg/mL的芦丁标准液。精确吸取0.00 mL，0.90 mL，1.20 mL，1.50 mL，1.80 mL，2.10 mL，2.40 mL芦丁标准液于10 mL容量瓶中，各加入5%NaNO2溶液0.50 mL，摇匀，静置6 min；加入10% Al（NO3）3溶液0.30 mL，摇匀，静置6 min；最后加入4%的NaOH溶液4.00 mL，用50%的乙醇定容至刻度，静置10 min，510 nm处测定吸光值，同时做空白对照，根据芦丁标准品在各浓度下吸光值变化情况，绘制芦丁标准曲线[7]，得到芦丁浓度与吸光值的标准曲线方程为Y=1.3759X-0.0056，相关系数R2=0.9996。

1.2.3 雪莲果叶黄酮的测定

称取1.00 g雪莲果叶粉末于圆底烧瓶中，根据实验条件，加入乙醇溶液回流提取，滤液抽滤后定容至100 mL，从中吸取1 mL滤液按测定芦丁标准曲线步骤进行显色反应，测定吸光值，根据以上标准曲线方程计算提取物的浓度，雪莲果叶黄酮提取量根据以下公式进行计算[8-9]：

提取量（mg/g）=（m1V1）/（V2m2）

式中：m1为测定时取样液中黄酮的含量，mg；

V1为样液的体积，mL；

V2为测定取样液的体积，mL；

m2为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 雪莲果叶中黄酮物质提取单因素试验

2.1.1 乙醇体积浓度对雪莲果叶黄酮提取量的影响

准确称取1.00 g雪莲果叶干粉，分别用不同体积浓度的乙醇20 mL，在60 ℃条件下进行提取1 h，测定提取液中黄酮含量，结果如图2所示。

图1 乙醇体积浓度对雪莲果叶总黄酮提取效果的影响

在不同乙醇体积浓度下，雪莲果叶总黄酮提取率随着乙醇体积浓度变化有不同变化趋势。由图1可知，当乙醇体积浓度较低时黄酮提取量随之增加，在40%时黄酮提取率最高，但乙醇体积浓度再增高，黄酮提取率增加趋势不明显，甚至出现浓度越高，提取率大幅下降，故对于雪莲果叶黄酮的提取适宜于低浓度的乙醇，乙醇浓度高也会使醇溶性杂质的溶出量也会增加，选择乙醇体积浓度在30%～50%范围内较合适。

2.1.2 料液比对黄酮提取量的影响

称取1.00 g雪莲果叶干粉，采用不同料液比加入40%乙醇，在60 ℃温度下提取1 h，测定提取液中黄酮含量，结果如图2所示。

图2 料液比对雪莲果叶总黄酮提取效果的影响

一般来说，溶剂使用量增加能促进提取物质溶出提取。由图2可知，料液比增大到一定值后，提取率会趋于稳定，不再溶出。提取溶剂过多会造成杂质溶出量增加，对提纯处理带来不便，同时也会造成溶剂浪费，综合以上因素考虑，选取料液比在1∶20～1∶40范围进行提取。

2.1.3 提取温度对黄酮提取量的影响

称取1.00 g雪莲果叶干粉，用体积浓度为40%的乙醇30 mL，在不同温度下提取1 h，测定提取液中黄酮含量，结果如图3所示。

图3 温度对雪莲果叶总黄酮提取效果的影响

一般来说，加热有利于溶剂的渗透，加速有效成分的扩散和提高溶出量。由图3可知，在一定温度范围内，黄酮类物质的提取量随温度增加而提高，但温度继续增加提取量却出现下降，说明温度升高到一定值后，对黄酮类化合物的结构有较大破坏，导致其提取量降低及其活性减少，故选择提取温度范围为50～70 ℃为宜。

2.1.4 提取时间对黄酮提取量的影响

准确称取1.00 g雪莲果叶粉，加入体积浓度为40%乙醇30 mL，在60 ℃下分别提取不同时间，测定提取液黄酮提取量，结果见图4所示。

图4 浸提时间对雪莲果叶总黄酮提取效果的影响

由图4可知，黄酮提取量随着提取时间的增加而增加，在1 h时能达到最高的提取量，为33.11 mg/g，提取时间继续增加之后提取量却急剧下降，当提取时间为3 h时提取量最低，可能是黄酮类化合物在长时间加热条件下分解所致，故确定提取时间为1 h。

2.1.5 提取次数对黄酮提取量的影响

准确称取1.00 g雪莲果叶粉，加入体积浓度为40%乙醇30 mL，在60 ℃下分别提取1次、2次、3次，4次，每次1 h，将每次提取的滤液合并，最后定容至同样体积，测定提取液黄酮提取量，结果如图5所示。

图5 提取次数对雪莲果叶总黄酮提取效果的影响

增加提取次数能使黄酮充分溶出提取，提高黄酮提取量，由图5可知，提取3次达到最高提取量，提取次数增加越多，黄酮提取量却降低，可能是由于提取时间过长有部分黄酮物质被分解所致。考虑到提取2次和3次的提取量相差不大，且提取次数越多效率也越低，杂质也随之增加，故确定提取2次较合适。

2.2 黄酮物质提取优化试验

称取1.00 g雪莲果叶粉9份，按照L9（34）正交试验设计表中不同提取条件对雪莲果叶进行黄酮提取，提取2次，合并滤液后测定黄酮含量。因素水平设计试验见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由表2可知，从极差R大小来看，RB＞RA＞RC＞RD，说明影响雪莲果叶黄酮提取效果的各因素的主次关系分别为提取温度、乙醇体积浓度、提取时间、料液比。确定雪莲果叶黄酮的最佳提取条件为A2B3C3D2，即乙醇体积浓度40%，提取温度70 ℃，提取时间1.5 h，料液比1∶30。表3中的方差分析表明，因素A、因素B、因素C即乙醇体积浓度、提取温度和提取时间达到极显著，其中提取温度的显著性最大，料液比因素对提取的影响达到显著水平。

2.3 验证试验

在以上确定的最佳提取工艺条件进行3次平行提取试验，提取量分别是52.37 mg/g、54.99 mg/g、52.86 mg/g，平均提取量为53.41 mg/g。

3 结论

在雪莲果叶黄酮提取工艺条件实验中，提取温度是影响雪莲果叶黄酮的最主要因素，通过正交优化实验，确定了乙醇浸提法提取雪莲果叶黄酮的最佳工艺条件为：用体积浓度40%的乙醇，在料液比为1∶30（g/mL）的溶剂条件下在70 ℃提取1.5 h，提取2次，在此条件下黄酮含量最高提取量为53.41 mg/g。结果表明，雪莲果叶中黄酮含量较高，具有较高的开发价值。

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［2］ 丁芳林，彭书练．超声提取荷叶黄酮工艺研究[J].湖南农业科学，2007（6）：175-177．

［3］ 刘北林，董继生，倪小虎，等.山楂黄酮提取及降血脂研究[J].食品科学，2007（5）：324-327.

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Optimal Extracting Conditons of Flavonoids from Yacon Leaves

CHEN Hong-hui1, LIU Fang1, SHEN Qing-qing2
(1. Institute of Chemical Engineering, WenShan University, WenShan, 663000, China; 2. Institute of Environment and Resource, WenShan University, WenShan, 663000, China)

In order to determine the best extract craft of flavonoids from Yacon leaves, the orthogonal experiment is used to optimize the condition, the effects of ethanol volume concentration, material-liquid ratio, extraction temperature, extraction time are researched. The optimal operational conditions of the extraction are: ethanol volume concentration 40%, solid to liquid ratio 1∶30 (g/mL) , extraction temperature 70℃, extraction time 1.5h, and extration twice. Under these conditions, the extracting yield is 53.41 mg/g. The optimized extract craft is stable with high extracting ratio.

Yacon leaves; flavonoids; ethanol extraction

R284.2

A

1674-9200（2014）06-0006-04

（责任编辑 张铁）

2014-04-18

云南省教育厅科学研究基金项目“雪莲果叶黄酮含量测定及抗氧化活性研究”（2013Y581）。

陈红惠（1979-），女，云南罗平人，文山学院化学与工程学院副教授，硕士，主要从事食品新资源开发及安全检测研究。