水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用

杨婷婷，刘雄伦，谭令辞，行 璇，文 婷，梁 毅，吴 俊，刘金灵，戴良英，刘建丰，王国梁

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；3中国种子集团有限公司，湖北武汉430206；4国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙410125；5湖南农业大学植物保护学院，长沙410128）

水稻Pi9基因序列标记的开发及其抗瘟育种应用

杨婷婷1，2，刘雄伦1，2，谭令辞1，2，行 璇1，2，文 婷1，2，梁 毅3，吴 俊4，刘金灵1，2，戴良英2，5，刘建丰1，王国梁1，2

（1湖南农业大学农学院，长沙410128；2作物基因工程湖南省重点实验室，长沙410128；3中国种子集团有限公司，湖北武汉430206；4国家杂交水稻工程技术研究中心，湖南长沙410125；5湖南农业大学植物保护学院，长沙410128）

利用广谱抗稻瘟病基因Pi9的3′UTR序列设计特异DNA标记pi9utr，通过分子标记辅助选择和连续回交育种实践，改良7份籼稻亲本（316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86）的稻瘟病抗性。结果表明：pi9utr是一个高效显性分子标记，除R207外，在其余6份受体亲本与Pi9供体亲本75-1-127间均存在明显而稳定的多态；在室内接种后的316B×75-1-127 BC4F1群体和R288×775-1-127 BC6F1群体中随机取样，进行稻瘟病抗性表型和基因型鉴定及Pi9基因表达分析，证明pi9utr对两个组合回交后代个体的抗病性辅助选择效率均为100%，且在所有抗病单株中均能检测到Pi9基因的高效表达，在所有感病单株中均没有检测到Pi9基因的表达。利用pi9utr在回交世代中的连续辅助选择，获得了3个组合的BC4F1及3个组合的BC6F2代群体，为选育抗稻瘟病新品种打下了基础。

水稻；稻瘟病抗性；Pi9基因；分子标记辅助选择育种

Key words：Rice；Blast resistance；Pi9 gene；Marker-assisted selection breeding

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约一半人口以稻米为主食［1］。作为水稻主要病害之一的稻瘟病（rice blast），可在水稻的不同生育时期造成危害，流行年份一般使水稻减产10%～20%，严重时甚至颗粒无收［2］。由于多数杂交稻亲本的稻瘟病抗性不强，很大程度上限制了一些强优势组合的推广应用。长期实践表明，发掘、鉴定和利用广谱持久抗性基因，选育和推广抗病品种（组合）是控制稻瘟病害最经济、有效和安全的策略［3］。分子标记辅助选择（Molecular Marker-assisted Selection，MAS）育种可定向改良个别性状而不改变受体遗传背景，且没有转基因生物安全性风险，是现代分子育种的重要手段。来源于小粒野生稻的抗瘟基因Pi9位于水稻第6号染色体的Pi2／9位点，与Pi2、Pizt、Pigm、Pi50、Pi2-2等抗瘟基因互为复等位基因，是一个已经被克隆的广谱持久抗性基因［4～9］。本研究利用Pi9基因序列设计并筛选高效DNA标记，应用分子标记辅助选择育种技术开展连续回交育种，定向改良受体籼稻亲本的稻瘟病抗性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

Pi9基因供体水稻亲本及稻瘟病室内接种抗病对照：75-1-127；Pi9基因受体水稻亲本：316B、金23B、R207、R228、R288、R389、明恢86（湖南杂交水稻研究中心、湖南农业大学水稻所提供）；分子标记选择效率及Pi9基因表达分析群体：316B×75-1-127 BC4F1、R288×75-1-127 BC6F1；稻瘟病室内接种感病对照水稻品种CO39；稻瘟菌菌株15份（本实验室收集保存，表1）。

1.2 方法

1.2.1 Pi9基因MAS育种分子标记的开发

Pi9基因，cDNA 4 009 bp，其中编码区3 099 bp，3′UTR 910 bp［5］。利用Pi9 cDNA序列信息设计分子标记，用各标记分别PCR扩增各供试水稻亲本的基因组DNA，分析各标记在Pi9供体亲本75-1 -127与7份受体亲本间的多态性，最终筛选出稳定高效的多态性标记用于MAS育种。

1.2.2 室内接种表型鉴定及抗谱分析

接种水稻材料包括Pi9供体亲本、受体亲本、316B×75-1-127 BC4F1群体、R288×75-1-127 BC6F1群体及感病对照水稻品种CO39，回交群体稻瘟菌菌株为110-2。供试水稻材料播种于塑料盆中，添加花卉营养土于温室（26～28℃，正常光照）中育苗。4叶期时采用单个菌株约1×105／mL浓度的稻瘟菌孢子悬浮液室内喷雾活体接种，26℃黑暗保湿24 h，再在26～28℃，高湿、正常光照条件下诱导发病5～7 d。参照Bonman的0～5级标准调查病情［10］（0～2级划为抗病类型，3～5级划为感病类型）。

1.2.3 标记基因型分析

室内接种后，对Pi9供体、受体亲本、各组合回交后代单株进行抗病表型鉴定的同时，分单株，各取2份新鲜叶片包于锡泊纸中（每份叶片约1.0 g），液氮速冻，放入-80℃冰箱中保存。之后，取出1份，用液氮研磨，CTAB法［11］提取叶片总DNA。用获选多态分子标记对各DNA样进行PCR扩增。PCR反应体系（10μL）：DNA模板（约10 ng／μL）1.0μL，2 pmol／μL primer pair 1.0μL，10×Buffer 1.0μL，2.5 mmol／L dNTPs 0.2μL，5U／μL r-Taq酶0.1μL，ddH2O 6.7μL。PCR反应程序：95℃预变性4 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸5 min。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，分析带型。结合单株表型和基因型的鉴定，验证多态分子标记的选择效率。

1.2.4 Pi9基因表达分析

将方法1.2.3中的另1份水稻叶片样品用Trizol法提取总RNA后反转录合成第一条cDNA链于-20℃暂时存放。用ubiquitin（正向序列：5′-AA GAAGCTGAAGCATCCAGC-3′，反向序列：5′-CCAGGACAAGATGATCTGCC-3′）扩增cDNA样品，PCR循环20次，反复调节cDNA模板浓度，使ubiquitin扩增条带亮度基本一致；再用上述多态标记引物PCR扩增相同浓度下的cDNA模板，琼脂糖电泳检测Pi9基因的表达。

1.2.5 MAS育种实践

利用获得的高效多态分子标记，用7份籼稻受体亲本与75-1-127具有多态的亲本作为Pi9基因的受体亲本及轮回亲本，开展MAS连续回交育种，改良受体亲本的稻瘟病抗性。本研究在前人工作基础上［12］，自2011～2013年继续在长沙和三亚两地穿梭进行MAS育种试验。将各组合回交后代分两期在田间单本种植，每期10～15株，苗期单株取样，用分子标记鉴定和选择抗病基因型，并结合田间农艺性状，筛选3～5个单株，与轮回亲本回交，构建各世代回交群体；达到BC6F1代的组合，分单株套袋自交获得BC6F2代，供下一步鉴定和筛选抗病纯系。

2 结果与分析

2.1 供试材料的稻瘟病抗性与抗菌谱

各供试材料对15个稻瘟菌菌株的抗性表现及抗菌谱结果见表1。Pi9基因供体及抗病对照75-1 -127的抗性较强、抗谱较广，对除ROR1和KOH外的其余13个菌株表现抗病；感病对照CO39对所有15个供试菌株均表现感病；7份受体亲本均对多数供试菌株表现感病，表明其稻瘟病抗性均需改良；7份受体亲本中，316B、金23B、R288的抗性最差，抗谱最窄；有趣的是，R389对Pi9基因感病菌株ROR1、KOH都表现抗病，说明R389中存在其他的抗瘟基因，改良后有望获得比75-1-127抗谱更广的新品种；另外，各受体材料均可找到多个区别于Pi9基因抗谱差异的特异致病菌株，可用于分子标记辅助选择效率验证的表型分析。

表1供试水稻材料的抗菌谱

2.2 多态分子标记的筛选

本研究中，利用Pi9基因序列信息设计了4对标记引物，分别对75-1-127和7份受体亲本进行基因型分析，筛选获得了多态性明显且稳定的显性标记pi9utr（正向序列：5′-CATCAGCGAACAGAT AGGGCA-3′，反向序列：5′-GCCCTGCTTGCTCG GAGTAGA-3′）。pi9utr在75-1-127和R207中均扩增出一条约1 000 bp的清晰稳定条带，而在其余6份受体亲本中均未检测出扩增产物（图1）。此结果表明，分子标记pi9utr在Pi9供体亲本75-1-127与316B、金23B、R228、R288、R389、明恢86这6份受体亲本间存在理想的多态性，可应用于这6对组合的MAS育种实践。

图1分子标记pi9utr对各亲本水稻的基因型分析

2.3 分子标记pi9utr的选择效率

为验证分子标记pi9utr对稻瘟病抗性表型的选择效率，确保MAS育种结果的可靠性，对316B×75 -1-127 BC4F1群体和R288×75-1-127 BC6F1群体进行室内接种，并分析两个群体中随机取样单株的基因型和表型。结果表明，pi9utr对两个回交后代的表型选择效率均为100%，所有抗病个体均扩增出一条约1 000 bp的清晰条带，所有感病个体均无扩增产物（图2）。

图2 2个回交群体的单株标记基因型与表型鉴定及Pi9基因表达分析

2.4Pi9基因的表达与抗病性关系

为了进一步验证Pi9基因在回交后代群体中的表达情况，选取316B×75-1-127 BC4F1群体和R288×75-1-127 BC6F1群体接种后随机取样单株（与2.3同），分别进行RT-PCR检测。结果表明，所有含Pi9基因且表型为抗病的个体都扩增出一条467 bp的条带，所有不含Pi9基因且表型为感病的个体均无扩增产物（图2）。由此可见，通过连续回交与标记辅助选择，目的基因Pi9被成功导入受体亲本中且高效表达，受体亲本的稻瘟病抗性明显改良。

2.5 分子标记pi9utr的MAS育种实践

利用pi9utr这个基因内高效多态分子标记，利用316B、金23B、R228、R288、R389、明恢86这6份籼稻材料作为Pi9基因的受体亲本及轮回亲本，于2009～2013年在长沙和三亚两地开展MAS连续回交育种。现已获得了316B、金23B、明恢86与75-1-127三个组合的BC4F1群体；R228、R288、R389与75-1-127三个组合的BC6F2群体，这些工作为进一步选育抗稻瘟病水稻新品系和新材料奠定了良好基础。

3 讨论

水稻稻瘟病抗性是一个典型的质量—数量性状，抗病性表型既由基因控制又受环境影响，因此传统育种方法很难进行准确选择，而分子标记辅助选择育种不但准确、高效、安全，而且可以在早期选择，在抗病性育种中显示出独特优势。本研究开发出Pi9基因内分子标记pi9utr，该标记在6份籼稻受体亲本的MAS连续回交育种中表现多态性明显稳定、选择效率高，既可用于基因型鉴定和选择，又可用于目的基因的表达分析。但是，pi9utr是一个显性标记，不能有效区分抗病纯合体和杂合体。鉴于此，应继续开发高效的共显性标记，在高代回交自交群体中筛选抗病纯系，提高育种效率。另外，pi9utr在Pi9基因供体亲本75-1-127与受体亲本R207间无多态性，需要开发新的多态标记用于R207的MAS育种。

由于稻瘟病菌生理小种的多样性及快速变异性，往往导致抗病水稻品种在不同稻区或年份间抗性不一致、不稳定，一定程度上限制了抗性基因和抗性品种的推广应用［13］。实践表明，将多个抗菌谱不同的抗瘟基因聚合到同一个水稻品种中，是培育广谱持久抗瘟新品种的良策［14，15］。本研究中的目标基因Pi9虽然抗性较强、抗菌谱较广，但对来自韩国的ROR1和来自日本的KOH两个菌株没有抗性。另一个广谱抗瘟基因Pigm，与Pi9相比具有交叉抗菌谱，对ROR1和KOH都表现出高水平抗性，但对Pi9基因具有抗性的来自我国湖北的小种鄂2007046A2没有抗性［16］。开展包括Pi9、Pigm在内的多个广谱抗瘟基因的聚合育种，培育出抗谱更广、抗性更强更持久的水稻新品种将是今后工作的重点。

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Development of the Pi9 Gene Marker and Its Breeding Practice in Rice Blast Resistance

YANG Ting-ting1，2，LIU Xiong-lun1，2，TAN Ling-ci1，2，XING Xuan1，2，WEN Ting1，2，LIANG Yi3，WU Jun4，LIU Jin-ling1，2，DAILiang-ying2，5，LIU Jian-feng1，WANG Guo-liang1，2

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；3 China Seed Group Co.Ltd，Wuhan，Hubei 430206，China；4 China National Hybrid Rice Research and Development Center，Changsha，Hunan 410125，China；5 College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

To improve blast resistance of seven receptor indica rice lines（316B，Jin23B，R207，R228，R288，R389 and Minghui86），a DNA marker，pi9utrwas developed based on the 3′UTR sequence of the broad-spectrum blast resistance gene Pi9 and marker-assisted selection breeding practice was imp lemented in this study.The main results were as follows：Pi9utr was a stable polymorphic dominantmarker for six of seven tested crosses except R207×75-1-127.The selection efficiency of the pi9utrmarker for blast resistance phenotype was100%，and the Pi9 gene showed high level expression in all resistant plants，according to random ly sampled individuals analyses of two backcross populations，316B×75-1 -127 BC4F1and R288×75-1-127 BC6F1.Pi9utr was employed formarker-assisted selection in consecutive backcross breeding of the six receptor rice lines，and BC4F1populations of three combinations and BC6F2populations of others three combinations were obtained，which provided basis for breeding of new rice varieties with blast resistant.

S511.032；S435.111.4＋1

A

1001-5280（2014）03-0231-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.01

2014 03 01

杨婷婷（1989-），女，浙江温州人，硕士研究生，Email：815035501＠163.com。

国家自然科学基金（31171526）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2013ZX08001-002）；教育部高校科技创新团队项目。