蓖麻毒蛋白前体基因的时空表达模式分析

（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128）

蓖麻毒蛋白前体基因的时空表达模式分析

金璐，邢超，刘阳，莫祎，阮颖*

（湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128）

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一类异二聚体复合物，包括一条具有催化活性的A链和具有半乳糖识别功能的B链，具有剧毒性。以RC2蓖麻为材料，利用半定量PCR和定量PCR技术分析蓖麻毒蛋白前体基因的时空表达模式。结果表明，在苗期蓖麻各组织中蓖麻毒蛋白前体基因不表达，而在成熟开花植株的各组织部位中，只在根和种子中有表达；而在种子发育过程中，授粉后1～2 d内，子房中蓖麻毒蛋白前体基因有表达，之后伴随种子生长发育特异性表达消失；授粉后24 d，蓖麻毒蛋白前体基因再次表达，并且表达量快速增高。这一规律的发现为进一步研究蓖麻毒蛋白合成积累以及选育低毒蓖麻提供了重要参考。

蓖麻；毒蛋白前体基因；半定量PCR；定量PCR；基因表达

蓖麻（Riciuns communis L.），属大戟科（Euphorbiaceae）双子叶一年或多年生草本植物。蓖麻种子中含60%的蓖麻油，可用作合成数以百计的各种化学衍生物，有“绿色石油”之称。去油后的蓖麻饼粕富含各种氨基酸，粗蛋白含量约为30%～40%，是普通粮食作物的3倍，但因饼粕中含有蓖麻毒蛋白（Ricin）这种剧毒性物质致使蓖麻饼粕不能直接用于配合饲料生产，需经脱毒处理［1～3］。

蓖麻毒蛋白是一种天然致命毒素，对所有哺乳动物的有核细胞都具有毒害作用。蓖麻毒蛋白属于Ⅱ型核糖体失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）。蓖麻毒素是从蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64 000［4］。毒素由A和B两条多肽链组成，两链间由一个二硫键连接。目前，A链和B链的氨基酸序列以及二级结构已基本清楚。毒素B链上含有两个半乳糖或半乳糖残基结合位点，可和细胞表面的含半乳糖残基的受体结合，通过内陷作用进入细胞质，发挥毒性作用。蓖麻毒素A、B链上还分别含有1和2个糖支链，链末端均为甘露糖残基，可以和网状内皮细胞特别是巨噬细胞结合［5，6］。后者细胞表面富含甘露糖受体，可优先摄取蓖麻毒素，这对于毒素发挥生物功能有重要的作用。研究表明，蓖麻毒蛋白由蓖麻毒蛋白前体合成，经修饰后主要储存在种子的胚乳细胞中［7，8］。从已经发表的资料来看，现在还缺乏对蓖麻毒蛋白在蓖麻植株中的系统时空表达研究资料。

笔者在蓖麻植株及蓖麻种子生长发育过程中，通过对蓖麻毒蛋白前体基因的时空表达进行系统研究，确定其时空表达模式，寻找出蓖麻毒蛋白合成积累与蓖麻植株生长发育过程间的规律，以为进一步研究其规律以及培育低毒蓖麻新品系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为蓖麻（Riciuns communis）RC2，由本校植物代谢调控与代谢工程实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培养条件

将RC2蓖麻种子播种于装有营养土的小钵中，置于生长室中萌发生长，后将萌发生长出子叶的幼苗移栽至大钵中，置于温室内生长，生长条件是温度25～35℃，长日照（14 h光／10 h暗），定期浇水及营养液。

1.2.2 取材

蓖麻苗期材料的收集。将蓖麻种子播种于小钵内，置于生长室，生长到14 d后，取其子叶和根；生长到20 d后，取其第一片真叶；待其继续生长7 d后，取其茎。

成熟植株和种子不同发育阶段的取材。待蓖麻植株生长至开花期，分别取其根、茎、叶及受精前1 d的雌花。待其开花后，采用人工授粉法并记录授粉时间（day after pollination，DAP），取1、3、5、7、9、11、13和15 DAP的子房，及18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40 DAP的种子。

1.2.3 蓖麻RNA提取及cDNA合成

在无菌环境下，采用RNA Extraction Buffer法［9］提取蓖麻不同生长时期、不同器官的RNA，溶于Free-RNase水中，-80℃保存。根据RNA逆转录试剂盒（Fermentas公司）操作说明，合成cDNA，用于半定量和定量PCR检测。

1.2.4 序列分析及引物设计

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻ACTIN全长CDS序列，设计ACTIN引物。

RC ACTIN F：5′-ATTTCCAAGGGCGAGTATG AC-3′

RC ACTIN R：5′-CCTTTACTGACTCCCACCT CC-3′

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻RICIN前体基因完整CDS序列，在基因库中进行BLAST比对和运用MEGA5.1软件分析比较，寻找序列中具有高保守性的区域，设计一对RTPCR引物和一对RT-qPCR引物。

Ricin F：5′-AATATACGGGAAACAGTTGTCAA GA-3′

Ricin R：5′-GCACAACTATTGTCTTGTGCATT CT-3′

Q-Ricin F：5′-ATAGTGGGTTGGTGTTAGAT GTGAG-3′

Q-Ricin R：5′-GTGCTCTTATTAGATACTGG ACTGC-3′

1.2.5 半定量PCR和定量PCR检测

半定量PCR检测：测定并调节cDNA浓度至800 ng／μL，用2×Taq MasterMix（康为世纪生物公司）和半定量引物Ricin F／Ricin R扩增目的片段，预期目的片段354 bp。反应体系（15μL）：Ricin F／Ricin R 0.25／0.25μL，2×Taq MasterMix 7.5μL，H2O 6μL，cDNA 1μL。反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性40 s；56℃退火40 s；72℃延伸40 s；72℃终延伸5 min，反应从第二步至第四步循环28次。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

定量PCR检测：测定cDNA浓度并稀释至5 ng／μL，用2×SYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（Thermo公司），仪器及分析软件为iQ5（Bio-Rad），以引物RC ACTIN F／R为内参，定量PCR引物Q-Ricin F／Q-Ricin R检测目的片段，预期目的片段189 bp。反应体系（20μL）：引物F／R 0.5／0.5 μL，2×SYBR Green Master Mix 10μL，H2O 6μL，cDNA 3μL。反应条件：Cycle1 95℃10 min；Cycle2 95℃10 s；60℃1 min，40个循环数；Cycle3 95℃1 min；Cycle4 60℃1 min；Cycle5 60℃10 s，71个循环数。其相对表达量以2ΔΔCT法计算［10］。

2 结果与分析

2.1 蓖麻毒蛋白前体基因的序列分析

经BLAST比对后，找到22条高同源性且具有完整表达框的序列，通过分析，发现在序列CDS区3′端含有一段最为特异的序列（图1），故选取此段作为目的检测区域。

图1 蓖麻毒蛋白前体基因高保守序列Fig.1 The conserved sequence ofRICINprecursor gene

2.2 蓖麻毒蛋白前体基因在苗期不同部位的表达

以蓖麻成熟种子为对照，对苗期的根、茎、真叶和子叶定量检测，结果显示在这些幼嫩的组织中基因的表达几乎检测不到，说明在蓖麻生长初期蓖麻毒蛋白前体基因在各组织中并不表达。

2.3 蓖麻毒蛋白前体基因在开花期植株不同部位的表达

利用半定量PCR，以ACTIN为内参，检测蓖麻开花期成熟根、茎、叶和授粉前1 d的雌花以及成熟的种子中蓖麻毒蛋白前体基因的表达情况。结果显示：蓖麻毒蛋白前体基因在成熟的根及种子内有表达，但在根中的表达量相比种子明显较弱，而成熟的茎、叶和未授粉的花中并未检测到基因转录产物（图2）。说明在开花期成熟植株的组织器官中，蓖麻毒蛋白前体基因在种子和根中有表达，而在其它部位没有蓖麻毒蛋白前体基因的表达。

图2 蓖麻开花期不同成熟组织中蓖麻毒蛋白前体基因的表达结果Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in differentmaturing tissues at floweringstage ofRiciuns communis

2.4 蓖麻毒蛋白前体基因在授粉后15 d内子房中的表达

蓖麻进入开花期后，采用人工授粉法并记录授粉时间，分别取授粉前1 d的雌花和授粉后1、3、5、7、9、11、13和15 d的子房。授粉后5 d，子房明显膨大，变绿并且表面出现雕纹。取上述材料，分别提取总RNA，反转录为cDNA，以ACTIN为内参，通过半定量PCR检测蓖麻毒蛋白前体基因的表达情况（图3）。结果显示：蓖麻毒蛋白前体基因在授粉后1 d有表达，2 d后亦有表达，但表达渐弱；而其他发育时期都未检测到蓖麻毒蛋白前体基因转录产物。说明在子房授粉后15 d内，在前期1～2 d内，蓖麻毒蛋白前体基因有表达，表达由强变弱；从第4～15 d，前体基因表达消失。

图3 蓖麻毒蛋白前体基因在蓖麻子房授粉后15 d内的表达Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in caster fertilized ovary w ithin 15 DAP

2.5 蓖麻毒蛋白前体基因在种子授粉18 d后的表达

对授粉后18～40 d的种子样品进行定量PCR检测，结果显示：以蓖麻成熟种子为对照，18～22 d的蓖麻种子中蓖麻毒蛋白前体基因表达量极低，24 d之后蓖麻毒蛋白前体基因表达量急剧增加，40 d的表达量几乎达到了种子中的40倍（图4）。

图4 蓖麻毒蛋白前体基因在蓖麻子房授粉18 d后的相对表达结果Fig.4 The relative expression level of RICIN precursor gene in caster fer tilized ovary after 18 DAP

3 讨论

蓖麻毒蛋白（Ricin）由蓖麻毒蛋白前体转化而来，前体基因主要编码三个功能区域，包括一个含有催化活性的N-端RIP结构域和两个具有糖识别功能的C -端凝集素结构域［11］。已有报道显示，蓖麻毒蛋白家族中可能含有28个可编码相似功能区域的假定家族成员，包括一些假基因和基因片段［12］。而我们从蓖麻基因组数据库中，提取所有蓖麻毒蛋白前体基因的同源序列，从中选取了22个具有完整读码框序列进行BLAST分析，根据比对结果，以高度保守的序列为基础，设计了蓖麻毒蛋白前体基因表达检测的引物对。通过定量和半定量PCR检测，发现苗期的根、茎、真叶和子叶中没有表达；在开花期的成熟植株中，只在种子和根中有明显表达，这种表达模式可能有利于降低蓖麻根与种子受到害虫的取食。综合半定量与定量PCR的结果，在授粉后，蓖麻种子的不同发育阶段，蓖麻毒蛋白前体基因的表达具有明显特征：授粉后第1 d表达量快速上升，但是第2 d表达量开始下降，第3 d表达停止，一直到授粉后第22 d，蓖麻毒蛋白前体基因又重新开始表达，并且表达量急剧上升，这种表达模式有利于后期蓖麻种子中蓖麻毒蛋白的大量积累。根据蓖麻毒蛋白前体基因的这种表达模式，推测该基因可能主要是在种子的胚乳组织中表达。因为在成熟的蓖麻种子中，主要贮存物的合成积累是在胚乳细胞中。已有报道发现在种子内胚乳发育首先形成无核胚乳，然后进入胚乳游离核细胞化阶段，最后逐渐发育为成熟的胚乳细胞，这一过程中伴随着油和蛋白的合成代谢［13，14］。在授粉后的前19 d，蓖麻种子迅速生长，其中含有约占90%的水和少量的淀粉，胚乳处于无核期，并在10～18 d内有一个重要的转化时期，主要以淀粉代谢为主转化为以脂肪酸代谢为主的过程；在授粉后24～40 d，胚珠退化，胚发育完成，无核胚乳细胞化，胚乳占据了种子的大部分体积，早期在胚珠中储存的淀粉也逐渐代谢为油脂储存在胚乳中，同时蛋白质也在逐渐积累增加［14］。在这期间，蓖麻毒蛋白前体基因的表达量也急剧上升，正好与胚乳的发育和胚乳中蛋白质积累模式相一致，因此蓖麻毒蛋白应该主要在胚乳中合成和储藏。授粉后40～54 d，胚乳细胞继续发育，但已无明显的变化［15］。

本实验还发现，蓖麻毒蛋白前体基因在授粉后第1 d有明显表达，至授粉后第3 d表达终止。这种授粉受精后的短暂表达，是什么原因引起的，是在什么部位完成的？都有待进一步研究确认。

［1］ 姚 远，李凤山，陈勇胜，等.国内蓖麻研究进展［J］.内蒙古民族大学学报，2009，24（2）：172-175.

［2］ 孙振钧，吕立媛，任玉鹏，等.蓖麻产业发展：从种植到利用［J］.中国农业大学学报，2012，17（6）：204-214.

［3］ 冀照君，杨文君，黄凤兰，等.蓖麻饼粕成分分析及研究进展［J］.内蒙古民族大学学报，2011，26（5）：545-548.

［4］ 苏雅拉图，黄凤兰，张继星，等.蓖麻毒蛋白的研究进展［J］.内蒙古民族大学学报，2010，25（4）：419-422.

［5］ 张 智，孙素荣，马 纪，等.植物中的核糖体失活蛋白及其抗病毒机制［J］.植物生理学通讯，2006，41（4）：537-541.

［6］ Spooner R，Watson P，Marsden C，et al.Protein disulphideisomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum［J］.Biochem J，2004，383：285-293.

［7］ Frigerio L，Jolliffe NA，Di Cola A，et al.The internal propeptide of the ricin precursor carries a sequence-specific determinant for vacuolar sorting［J］.Plant Physiology，2001，126（1）：167-175.

［8］ Roberts LM，Smith DC.Ricin：the endoplasmic reticulum connection［J］.Toxicon，2004，44（5）：469-472.

［9］ Wadsworth GJ，Redinbaugh MG，Scandalios JG.A procedure for the small-scale isolation of plant RNA suitable for RNA blot analysis［J］.Analytical Biochemistry，1988，172（1）：279-283.

［10］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method［J］.Nature Protocols，2008，3（6）：1101-1108.

［11］Jolliffe NA，Brown JC，Neumann U，et al.Transport of ricin and 2S albumin precursors to the storage vacuoles of Ricinus communis endosperm involves the Golgi and VSR -like receptors［J］.The Plant Journal，2004，39（6）：821-833.

［12］Chan AP，Crabtree J，Zhao Q，et al.Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis［J］.Nature Biotechnology，2010，28（9）：951-956.

［13］Chen GQ，He X，McKeon TA.A simp le and sensitive assay for distinguishing the expression of ricin and Ricinus communis agglutinin genes in developing castor seed（R.communis L.）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53（6）：2358-2361.

［14］虢婷婷，刘祥华，邢 超，等.蓖麻栽培品种的遗传多样性及蓖麻籽脂肪酸组分分析［J］.湖南农业大学学报：自然科学版，2012，38（4）：373-376.

［15］Chen GQ，Turner C，He X，et al.Expression profiles of genes involved in fatty acid and triacylglycerol synthesis in castor bean（Ricinus communis L.）［J］.Lipids，2007，42（3）：263-274.

Analysis on Spatiotem poral Expression Patterns of RICIN Precursor Gene of Ricinus communis

JIN Lu，XING Chao，LIU Yang，MO Yi，RUAN Ying*

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

RICIN，a heterodimeric complexwith hypertoxicity，is composed of one bind of A-chain with catalytic activity and one bind of B-chain with recognition function for galactose.In this paper，the temporal and spatial expression patterns of RICIN precursor gene in Ricunus communis was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and real-time quantitative PCR with caster RC2 asmaterial.The results showed that the RICIN precursor gene did not express in any tissues at seedling stage，and only in the roots and seeds at the flowering stage.During the seed developing progress，the RICIN precursor gene expressed in ovaries within 1～2 days after pollination（DAP），and then silenced with the development of seeds.While on 24 DAP，the RICIN precursor gene re-expressed and the expression levelwas rapidly increased.This discovery provides important references for further research on synthesis and accumulation of RICIN and breeding of low-toxicity caster strains.

Riciuns communis；RICIN precursor gene；Semi-quantitative RT PCR；Real-time quantitative PCR；Gene expression

Q786

A

1001-5280（2014）03-0254-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.06

2014 03 12

金 璐（1989-），女，山西五台县人，硕士研究生，Email：jinlu425＠163.com。*通信作者：阮颖，教授，Email：yingruan＠hotmail.com。

国家973项目（2011CB111514）。