抗氰新药DDD和4－二甲基氨基苯酚对大鼠高铁血红蛋白浓度的影响＊

林 海，蔡 颖，但国蓉，董兆君

（1．第三军医大学新桥医院医教部，重庆400037；2．第三军医大学军事预防医学院，重庆400038）

氢氰酸（hydrogen cyanide，HCN）、氰化钠（sodi －um cyanide，NaCN）、氰 化 钾 （potassium cyanide，KCN）是剧毒的化学物质，因其分子中都含有氰基（CN），故又称作氰类化合物。此类化合物是非常重要的工业原料，在冶金、制药、塑料、化纤、制革等行业有广泛的用途。因化学泄露而导致的人员伤亡事故时有发生。HCN和氯化氢（cyanogen chloride）又是外军装备速杀型化学战剂，其毒性大、作用快，能在短时间内造成大批人员中毒死亡，被视为大规模杀伤性武器［1－3］。因此，对氰中毒的防治研究一直是军事医学和预防医学的重点方向。迄今效果较佳的抗氰药物是高铁血红蛋白（methemoglobin，MHb）形成剂，主要的有亚硝酸钠（亚硝酸钠）、亚硝酸异戊酯（amyl nitrite）、4－二 甲 基 氨 基 苯 酚 （4－diaminophenol，4－DMAP）和对氨基苯丙酮（P－Aminopropiophene）作用快，抗氰能力都强，但需要消耗大量的血红蛋白，容易造成缺氧而加重病情的发展，甚至有造成MeHb血症的危险，尤其不适用于火灾现场氰中毒救治［4～9］。因此，寻找新型抗氰药物是当前该领域的重大任务。本单位自本世纪初发展了新一代抗氰药物DDD，它能利用全新的概念清除体内的游离氰离子。前期试验业已证实效果良好，尤其在中毒前用药时能发挥极好地预防效果。但该化合物是否也能形成MHb，是该化合物能否发展成为新型抗氰药物的前提。为此，我们以wistar大白鼠为实验对象，以4－DMAP为实验对照，比较二者在常氧和缺氧条件下形成MeHb的能力，其结果对于阐明该药的药理学特征，保证其临床安全应用具有重要意义。

1 材料和方法

1．1 试剂和仪器 铁氰化钾 K3［Fe（CN）6］购自美国Fluka公司，临用前新鲜配制。DDD为第三军医大学防化教研室合成，4－DMAP由军事医学科学院毒物药物研究所提供，纯度大于95%，新鲜配制。其他试剂均为国产分析纯。752型分光光度计为上海沪奥明科学仪器有限公司生产。

1．2 动物及实验分组 wistar大白鼠雌雄各半，体质量241±5g，由第三军医大学实验动物中心提供，常规饮料喂养。选取大鼠40只随机分为AB两大组，各下设对照、10min、30min和60min四个亚组。对A组大鼠，按照5ml／kg容积通过灌胃针给予DDD（100mg／kg）。0min组大鼠则以同法给予蒸馏水；对于B组大鼠，按照5ml／kg容积通过腹腔注射4－DMAP（3mg／kg）。0min组大鼠则以同法给予蒸馏水。于设定的时间点处死动物，取全血，测定MeHb含量。再取大鼠30只，随机分成C、D、E、F、G、H等组，每组5只。C、D、E组分别以灌胃法给予 DDD 50、100、150mg／kg；F、G、H 组则分别以腹腔注射法给予4－DMAP 1．0、2．0和3．0mg／kg。同样于设定的时间点处死动物，取全血，测定MeHb含量。

1．3 Hb和 MHb测定 Hb测定按照文献［7］报道方法进行，稍加改进。试管中加入血红蛋白测试液（0．05g氢氧化钠，0．20g高铁氰人钾0．14g磷酸氢二钾，1ml Triton X－100，加蒸馏水至1000ml）5ml，吸取20ul红细胞悬液，擦去吸管外血液后，轻轻加于试管底部，混匀后作用5min，540nm比色得吸光度。计算血红蛋白 Hb总量（g／L）＝A×251×64458／44000＝A×36717。

高铁血红蛋白测定，血样稀释：取1离心管加入5ml的1／60磷酸盐溶液和血样50ul即成。取两只容量为1．5ml的EP反应管，分别标记为标准管和测定管。各加入1ml稀释血样，以1／60磷酸盐溶液调零。测定管比色OD630nm值记为A1，加入中性氰化钠溶液1滴混匀，2min后比色得OD630nm值记为A2．标准管先加入10%铁氰化钾溶液1滴混匀，2min后测OD630nm值，记为A3。再加入中性氰化钠溶液1滴，混匀，2min后比色测OD630nm值，记为A4。所得结果按照下式计算：MHb%＝（A1－A2）／（A3－A4）×100%，MeHb含量（g／100ml）＝Hb含量×MHb%。

2 结果

灌胃DDD大鼠在观察时间内无任何异常表现。腹腔注射4－DMAP的大鼠除在5～30min内活动减少外，也未出现其他异常表现。

2．1 时间－效应结果 如表1所示，大鼠以DDD处理后60min内，血液MeHb含量略有波动，但未出现有统计意义的变化。而腹腔注射4－DMAP的大鼠，10min血液 MeHb显著升高，30min达到最高值。60min时血液MeHb含量有所下降，但仍远远高于对照水平。10、30、60min分别为对照的 3．58、9．32、8．02倍。

表1 DDD和4－DMAP对大鼠血液MeHb含量的影响［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表1 DDD和4－DMAP对大鼠血液MeHb含量的影响［±s，n＝5（×10－2）］Table 1 Effect of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

注：与对照组比较①P＜0．05

组别 对照 给药后时间（min）10 30 60 2．87±0．32 2．42±0．19 2．56±0．41 A 2．24±0．25 B 2．41±0．32 8．62±0．93①①19．33±4．12①

2．2 剂量－效应结果 表2所列为给药30min后，DDD和4－DMAP对大鼠血液MeHb浓度的影响。由表中数据可见，DDD在所选剂量范围内不明显改变血液MeHb浓度。4－DMAP与DDD不同，血液 MeHb浓度随着用药剂量的增加而升高。若以表1的对照组结果（2．41）为基点进行计算，当剂量为1．0、2．0、3．0mg／kg时 的 MeHb 浓 度 分 别 升 高 6．63、8．32、11．89倍。

表2 不同剂量DDD和4－DMAP对大鼠血液MeHb含量的影响［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

表2 不同剂量DDD和4－DMAP对大鼠血液MeHb含量的影响［±s，n＝5（×10－2）］Table 2 Effect of different doses of DDD and 4－DMAP on MeHb in rat blood

药物 剂量分组A B C A 2．35±0．44 2．42±0．19 2．71±0．42 D E F B 18．54±2．93 22．47±3．67 31．08±4．04

3 讨论

分子中含有氰基的化学物质统称为氰类化合物，包括前述的氰化氢（HCN）、氰化钠（NaCN）、氰化钾（KCN）和氯化氰（CNC1）等。HCN、NaCN、KCN 是用途非常广泛的化工原料，可以作为原材料，也可以作为中间体。其生产、储存量及市场需求非常巨大。因保管、运输使用不当所造成的泄露事故屡见不鲜。HCN和CNC1则是外军装备的化学战剂。虽然有国际禁止化学武器公约的限制，世界各国均承诺不生产、储存和使用化学武器，但由于氰类毒剂制造方法非常简单，生产成本低，隐蔽性很大且杀伤力极强，在未来战争中使用的可能性仍然很大。因此，对化学战剂，特别是对氰类战剂的防护是当前国内外军事医学的研究重点。

真核细胞线粒体的细胞呼吸链是由一系列的递氢体和电子传递体（eletron transfer）组成的一个连续反应体系。其主要职责是负责将底物脱下的氢原子交给氧生成水，同时生成三磷酸腺苷（ATP）。其主要的限速酶是位于呼吸链最后的细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）。COX 的催化过程如同戏剧般地复杂和奇妙，历经多次电子转移之后，最终使一个氧气分子还原为两个水分子。期间净利用了还原的细胞色素c提供的4个电子（e）。消耗了8个质子，但又产生了4个质子。而这些电子的传递过程离不开血红素A。

COX的血红素A是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子（Fe2＋）配位结合。Fe2＋能结合分子氧，而对CN的其亲和力。外源性氰化物进入体内后很快解离除CN－，后者通过弥散作用进入线粒体并迅速与COX的Fe2＋或者Fe3＋结合，使之丧失传递e的能力。这就是氰化物中毒的本质［8］。

迄今为止，国外自上世纪50年代开始研究，70年代到高峰：我国自上世纪80年代开始研究，90年代达到高峰。迄今已研发了四代抗氰药物：①第一代以美兰和硫代硫酸钠为代表。美兰临床科用于治疗尿路结石、治疗闭塞性脉管炎等。也用于治疗氰化物中毒，但用量大，需要静脉注射，且有恶心、腹痛、心前区痛、眩晕、头痛、出汗和神志不清等不良反应。后者能结合氰离子，临床效果也不错。但该药也只能静脉注射，用量同样很大。②第二代是亚硝酸盐类化合物，主要有亚硝酸钠和亚硝酸异戊枉费。前者只能静脉滴注，后者只能经呼吸道吸入使用。二者有共同的作用原理，即可以措施体内的血红蛋白转化为MeHb。MeHb即可竞争氰离子，从而发挥抗氰作用。但他们都有很明显的心血管副作用，可能导致血管扩张和血压剧变。加之其结合氰离子并不牢固，其效果不稳定，容易临床症状的反复，逐渐引起众的厌弃。③第三代是氨基酚类化合物，以4－DMAP和PAPP为代表。它们与亚硝酸盐类比较有明显的优势：可以肌肉注射，也可以口服，适用比较方便；吸收极为迅速，即使在发生休克时然可以在5min内达到需要的血药浓度；在体内的半衰期比较长，维持药效时间比较久。救治氰中毒时，4－DMAP只需注射一次；预防氰中毒时，PAPP可以预防12h［9］。④第四代即目前各国正在研究开发的新型的或新作用原理的抗氰药物。DDD即为其中之一，其设计思路是为机体提供一种能结合氰离子的前体物质，待其进入体内后可自动转化为能结合氰离子的物质。可见，氨基酚类抗氰药物虽然抗氰效果好，但由于其能消耗大量血红蛋白，有不适合于缺氧环境的致命弱点，也有形成极高MeHb血症的风险。因此，新设计的DDD必须具备不形成MeHb的特性。

实验结果显示，正常大鼠血液存在一定浓度的MeHb，其含量不越过3%。给予4－DMAP后血液MeHb含量迅速升高，30min达到高峰，60min虽然有所下降，但仍远高于对照水平。这与早期结果基本吻合，也是4－DMAP 具有良好抗氰效果的基础［7，10～14］。但从表1数据可以看出，口服DDD后60min内大鼠血液MeHb浓度基本不受影响。这说明DDD不具备形成MeHb的能力。从理论上分析，4－DMAP是一个含有苯基的化合物，具有很强氧化还原活性，所以能够促使血红蛋白之血红素A的铁离子（Fe2＋）转变为Fe3＋。但DDD不具备氧化还原活性的结构，它只能提供一个巯基。所以没有使血红蛋白转化为MeHb的可能。在50、100、150mg／kg三中剂量时，它都没引起大鼠血液MeHb浓度的明显变化。因此，可以基本上判断该药于MeHb形成没有因果关系。但是，能够促使血液氰离子排泄而具有抗氰作用的药物还很多，如硫代硫酸钠、羟钴胺素等。DDD的药效评估尚需其他的试验结果予以证实。

4 结论

本研究结果显示，4－DMAP是 MeHb形成剂，DDD不具备形成MeHb的能力。

［1］ 欧阳子倩，王延治．全身中毒性毒剂［M］．上海：上海科学技术出版社，1985：346．

［2］ Laquer W．Postmodern terrorism［J］．Foreign Affairs，1996，76：24－361．

［3］ Rhee J，Jung J，Yeom H．Distribution of cyanide in heart blood，peripheral blood and gastric contents in 21cyanide related fatalities［J］．Forensic Sci Int，2011，210（1－3）：12－15．

［4］ Leavesley HB Li L，Mukhopadhyay S，et al．Nitrite－mediated antagonism of cyanide inhibition of cytochrome c oxidase in dopamine enurons［J］．Toxicol Sci，2010，115（2）：569－576．

［5］ Aslan A，Osmanagaoglu S．Cavolli R，et al．Sodium nitroprusside infusion prevents hypothyroidism in patients undergoing coronary artery bypass grafting：aprospective randomized clinical trial［J］．J Cardiovasc Med（Hagerstown），2010；11（8）：575－582．

［6］ 耿 煜，刁天喜．美国应对化学战剂突发事件的紧急公共卫生保障研究［J］．中国卫生事业管理，2005：（4）：198－201．

［7］ 叶华虎，袁菊芳，王艳静，等．缺氧环境下氰化物的毒性变化及4－DMAP的解毒效果研究［J］．解放军医学杂志，2006，31（11）：1090－1092．

［8］ Keilin D．Cytochrome and intracellular oxidase．Proc R Soc，1930，B106：418－444．

［9］ Kerger H，Dodidou P，Passani－Kruppa D，et al．Excessive methaemoglobinaemia and multi－organ failure following 4－DMAP antidote therapy［J］．Resuscitation，2005，66（2）：231－235．

［10］ 孙晓红，于泽钦，杜先林，等．MeHb形成剂的作用比较［J］．中国工业医学杂志，1998，（3）：18－20．

［11］ 邢小喜，何 悦，叶 枫，等．4－对二甲氨基酚和缺氧对犬高铁血红蛋白及心电信号的影响［J］．局解手术学杂志，2011，20（3）：255－257．

［12］ 叶华虎，袁菊芳，邓继先，等．缺氧环境下4－DMAP形成高铁血红蛋白的药效学特征［J］．解放军医学杂志，2006，31（11）：1090－1092．

［13］ 袁菊芳，叶华虎，李奇慧，等．金秀4－DMAP对缺氧红细胞生成高铁血红蛋白的效应特点［J］．第三军医大学学报，2003，25（14）：1227－1229．

［14］ Lawson－Smith P，Olsen NV，Hyldegaard O．Hyperbaric oxygen therapy or hydroxycobalamin attenuates surges in brain interstitial lactate and glucose；and hyperbaric oxygen improves respiratory status in cyanide－intoxicated rats［J］．Undersea Hyperb Med，2011，38（4）：223－237．