石榴皮游离与结合态多酚的组成和抗氧化性研究

原 田，刘邻渭，高忠梅，赵贝塔

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

石榴皮游离与结合态多酚的组成和抗氧化性研究

原 田，刘邻渭*，高忠梅，赵贝塔

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

目的：研究石榴皮游离与结合态多酚含量、组成和抗氧化性的异同，为其提取和利用提供依据。方法：将3个石榴品种的成熟果实分别制成4类皮粉，采用超声提取法和碱液溶出法制取各皮粉的游离态和结合态多酚，采用3种方法测定其酚类组成和含量，采用4种方法评价其抗氧化能力。结果：4类皮粉的游离态多酚、类黄酮和单宁含量分别为107.55～157.60mg GAE/g DW、24.24～44.54mgQUE/gDW和143.03～231.44mgTAE/gDW，结合态多酚、类黄酮和单宁含量分别为7.35～30.89mgGAE/g DW、2.25～11.56mgQUE/gDW和9.01～18.86mgTAE/g DW。全皮、外层皮、内层皮和皮渣粉的多酚含量差异显著（p＜0.05），其中皮渣游离态多酚含量最低而结合态多酚含量最高，各品种的同类皮粉的多酚含量有显著差别（p＜0.05）。同一皮粉的游离态和结合态多酚的抗氧化能力彼此相近，其大小与多酚和单宁含量均显著相关（p＜0.01）。结论：提取石榴皮多酚的材料可根据原料的实际状况而选全皮、内层皮或皮渣，提取游离酚可获取材料中大部分多酚。结合态多酚的抗氧化能力与游离态多酚相似但含量低。

石榴皮多酚，游离态多酚，结合态多酚，抗氧化

石榴（Punicagranatum Linn）为石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）落叶灌木或小乔木类植物，主要分布于亚热带及温带地区，是我国重点发展的水果之一，目前栽植面积达8万公顷，产量达100万吨[1]。石榴皮约占石榴的10%～20%，一般厚度为1.5～3mm，味苦涩[2]，但具有多种活性成分，多被废弃，是巨大的浪费[3]。现代医学研究证明，石榴中含有多酚、黄酮、鞣质、生物碱和有机酸等多种抗氧化活性物质，能够减少自由基对人体的破坏，从而可以延缓衰老、抑制癌变、软化血管、降低胆固醇，防治冠心病和高血压等多种疾病[4-6]。尤其是石榴皮和石榴汁中的多酚，它具有抗氧化活性，能够延缓动脉硬化、减少心脏病发生的几率，在食品、医药等领域有巨大的应用价值[7]。目前，提取和定性石榴皮多酚的研究已很多[8]，但尚未对其结合态多酚开展研究。Chu等[9]和Sun等[10]研究表明，蔬菜和水果中的多酚以游离和结合两种形态存在，前者通常指水或极性溶剂可溶性酚类，后者指不溶性并主要以酯键、糖苷键、醚苷键等形式与其他物质（包括蛋白质单糖有机酸等）相结合的酚类。当食物经过胃和小肠的消化后，结合酚能够完好的到达结肠，释放后产生生理活性[11]。石榴皮厚，表层和内层具有明显区别，在成熟期间表层常出现裂纹并带有较多微生物，贮运中表皮更早受伤变质，加工石榴时如何处理石榴皮将明显影响到产品的卫生和品质。总之，对石榴皮多酚分布和对结合态多酚的含量、组成和功能研究不足，必然造成石榴皮深加工利用技术粗放和低效，也限制人们对石榴皮直接用于食品和饲料利弊的认识和探讨。因此，本研究以三个感官性质差异鲜明的石榴栽培品种的果皮为材料，将果皮分别分为全皮、外层皮、内层皮和皮渣4个部位，系统测定了其中游离态和结合态多酚的含量、组成和体外抗氧化功能，通过对测定结果的对比、分析和讨论，为石榴皮科学加工利用提供了有一定新颖性的实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

净皮甜石榴、三白甜石榴、酸石榴 陕西省西安市秦陵石榴研究所；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-dipheny 1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、ABTS+[2，2-azion-（3-ethylbenzothiazoline-6-sul2fonic acid）] AR级，美国Sigma公司；抗坏血酸、一水合没食子酸、单宁酸、槲皮素、铁氰化钾[K3Fe（CN）6]、三氯乙酸（TCA）、三氯化铁（FeCl3）、磷酸、盐酸、无水乙醇、氢氧化钠、碳酸钠 国产分析纯。

7230G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司；SHB-3型循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；THZ型台式恒温振荡器、电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；BL6-180A型超声波清洗机 西安比朗实验设备有限公司；高速离心机 长沙英泰仪器有限公司；pH计 方舟科技。

1.2 实验方法

1.2.1 果皮的处理 将石榴果皮（包括整皮、果粒座架组织及分隔膜片）定义为全皮，将果皮外表层约2mm厚的带颜色层削下来，定义为外皮，其余部分定义为内皮，将全皮榨汁后的残渣定义为皮渣。将各处理果皮样品置于50℃烘箱烘干，磨粉，完全通过80目筛，得到不同皮粉样品。

1.2.2 石榴皮游离态多酚的提取 参考文献[12]方法并略作改动，按料液比1∶5将石榴皮粉与乙醚-石油醚（3∶2，v/v）混合溶剂混合，超声脱脂10min，抽滤，烘干，得到脱脂粉。称取0.2g脱脂粉置于15m L离心管中，按1∶20料液比加入60%的乙醇溶液，漩涡混匀，35℃下超声提取20min，离心后取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液，定容至10m L，得游离态多酚提取液，4℃下暂存，待分析。残渣用于结合态酚类物质提取。

1.2.3 石榴皮结合态多酚的提取 参考Byungrok等[13]方法并略做改动。向含有1.2.2残渣的离心管中加入4m L 2mol·L-1NaOH溶液，充入氮气密封后，室温振荡1h。4000r/m in离心10m in，所得上清液用6mol·L-1HCl溶液调节pH至2，水定容至10m L，得到结合态多酚提取液，4℃下暂存，待分析。

1.2.4 多酚含量的测定 采用中Folin-Ciocalteu[14]方法，以没食子酸为标准品做标准曲线，水为空白对照，重复测定3次，多酚测定结果以皮粉样品中没食子酸当量mg GAE/g DW表示。

1.2.5 总黄酮含量的测定 采用文献[15]中所述的A lCl3显色方法，吸取试液0.5m L于具塞试管，依次加入1.5m L95%乙醇，0.1m L 10%AlCl3溶液，0.1m L 1mol/L KAc溶液，2.8m L蒸馏水，充分混匀后在室温静置30min，于415nm处测定该试液的吸光度。以槲皮素为标准做标准曲线，槲皮素用95%乙醇溶解，以95%乙醇作为空白对照，重复测定3次。结果以皮粉样品中槲皮素当量mgQUE/gDW表示。

1.2.6 单宁含量的测定 采用文献[16]中所述的Folin-Denis显色法，吸取试液1m L于具塞试管，依次加入水12.5m L、Folin-Denis试剂1.25m L、15%碳酸钠溶液2.5m L，加水稀释至刻度，混匀。避光放置1h后，于700nm处测定该液的吸光度。以单宁酸为标准做标准曲线，以水为空白对照，重复测定3次。结果以皮粉样品中单宁酸当量mgTAE/gDW表示。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的测定 采用文献[17]中所述的方法，精确称取0.0128g DPPH，用无水乙醇溶解并定容至50m L，作为DPPH储备液（0.649mmol/L），稀释5倍为工作液（0.129mmol/L）。吸取1m L试液，加入4m L DPPH工作液，在室温条件下避光放置10m in，以无水乙醇调零于520nm处测定该液的吸光度（Ai）。同时，测定1m L无水乙醇和4m LDPPH工作液混合液的吸光度（Ac）和1m L试液和4m L无水乙醇混合液的吸光度（Aj），按下式计算试液的DPPH自由基清除率（SA）：

以没食子酸为标准品制作标准曲线，水为空白对照，重复测定3次。结果以皮粉样品的没食子酸当量表示（mgGAE/gDW）。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力的测定 采用文献[18]中所述的方法，吸取200μL试液加入4m L ABTS+·工作液中，混合均匀，室温下避光静置10m in后，以无水乙醇调零于波长734nm下测其吸光度（Ai），以200μL无水乙醇代替试液，按同上步骤做空白测定得到（Ac），以4m L蒸馏水代替ABTS+·工作液，按同上步骤做样品本底测定得到（A j）。按下式计算样液的ABTS+自由基清除率（SA）：

SA（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100

以没食子酸为标准制作标准曲线，水为空白对照，重复测定3次，结果以皮粉样品的没食子酸当量表示（mgGAE/gDW）。

1.2.9 总还原能力的测定 采用文献[19]方法，普鲁士兰比色法。取试液0.5m L，加入pH 6.6的磷酸盐缓冲液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5m L并混合均匀，混合液于50℃保温20m in后加入2.5m L，10%的三氯乙酸溶液，混合后以3000r/min离心10min。取上清液2.5m L，加2.5m L蒸馏水和1m L 0.1%的FeCl3，混合均匀，10min后以蒸馏水调零于700nm测吸光度。以没食子酸为标准制作标准曲线，水为空白对照，重复测定3次。结果以皮粉样品的没食子酸当量表示（mgGAE/gDW）。

1.2.10 总抗氧化力的测定 采用文献[20]方法，取0.4m L试液于试管中，加入4m L磷钼试剂，于95℃水浴中保温90min，于695nm下测定该液的吸光度。以没食子酸为标准制作标准曲线，水为空白对照，重复测定3次。结果以皮粉样品的没食子酸当量表示（mgGAE/gDW）。

1.2.11 统计分析 采用DPS6.55软件进行显著性与相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 酚类成分含量测定标准曲线

没食子酸、槲皮素、单宁酸含量测定标准曲线图见图1，在测定范围内，线性关系良好，可以用于三种物质含量的测定。

图1 没食子酸、槲皮素、单宁酸含量测定标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid，quercetin acid and tannin acid contents determination

2.2 不同皮粉酚类物质含量

供试品种石榴的各种皮粉游离态和结合态没食子酸、黄酮和单宁含量如表1所示。

表1 供试品种各石榴皮粉的酚类成分含量Table 1 Phenolic compositions and contents of different peel powers of the tested pomegranate cultivars

从表1可以看出，各种皮粉的游离态多酚含量在107.55～157.60mgGAE/gDW之间，其中净皮甜外皮的含量最高，净皮甜皮渣的含量最低；各样品的结合态多酚含量范围在7.35～30.89mgGAE/gDW之间，其中三白甜皮渣的含量最高，三白甜全皮的含量最低。从显著性分析结果可以观察出，不同品种不同部位的游离态和结合态多酚之间均存在一定差异性，皮渣组的游离态多酚含量显著低于其他组（p＜0.05），而结合态多酚显著高于其他组（p＜0.05）。

各种皮粉的游离态总黄酮含量在24.24～ 44.54mgQUE/gDW之间，其中内皮组的含量较其他组高，净皮甜内皮的含量最高，外皮的含量较低，酸石榴外皮的含量最低；各种皮粉的结合态总黄酮含量在2.25～11.56mgQUE/gDW之间，其中三白甜皮渣的含量最高，酸石榴外皮的含量最低。从显著性分析结果来看皮渣组结合态总黄酮含量显著高于其他组（p＜0.05）。

各种皮粉的游离态单宁含量在143.03～ 231.44mgTAE/gDW之间，三个品种的石榴皮游离态单宁含量由高到低为三白甜、净皮甜、酸石榴，三种石榴的皮渣组的游离态总单宁的含量普遍低于其他各种皮组；各种皮的结合态单宁含量在9.01～ 18.86mgTAE/gDW之间，其中皮渣组含量高于其他组（p＜0.05）。

2.3 抗氧化能力测定标准曲线

DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、总还原力、总抗氧化力测定标准曲线图见图2。

2.4 各品种皮粉抗氧化能力比较与分析

各品种皮粉抗氧化能力如表2所示，其中包含4个评价指标（DPPH·清除力、ABTS+·清除力、总还原力和总抗氧化力）。

从表2可看出，不同皮的游离态多酚清除DPPH自由基的能力在51.36～98.99mgGAE/gDW之间，其中三白甜石榴果皮（特别是其外层皮）的游离态多酚清除能力最大，净皮甜皮渣的清除能力最小；不同皮的结合态多酚清除DPPH自由基的能力在3.94～ 9.80mgGAE/gDW之间，其中净皮甜皮渣的清除能力最强，酸石榴外层皮的清除能力最弱。

不同皮的游离态多酚清除ABTS+自由基的能力在70.03～111.40mgGAE/gDW之间，其中三白甜石榴果皮（特别是其外皮）的游离态多酚清除能力最大，净皮甜皮渣的清除能力最小；不同皮的结合态多酚的清除能力在3.96～16.09mgGAE/gDW之间，其中三白甜皮渣的清除能力最强，三白甜全皮的清除能力最弱。

不同皮的游离态多酚的总还原能力在97.22～ 156.78mgGAE/gDW之间，其中三白甜外皮的最强，其他石榴的全皮和内皮的能力较强，皮渣粉的能力相对略低，其中净皮甜皮渣能力最弱；不同皮的结合态多酚的总还原能力在4.68～27.22mgGAE/gDW之间，其中皮渣的能力成倍高于果皮的，三白甜皮渣的能力最高，三白甜全皮的能力最弱。

图2 DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、总还原力、总抗氧化力测定标准曲线Fig.2 Standard curve of DPPH radical cation scavenging，ABTS radical cation scavenging，reducing power and antioxidant activity assays

不同皮的游离态多酚的总抗氧化力在147.25～ 237.85mgGAE/gDW之间，其中三白甜外皮的最强，净皮甜皮渣的最弱；不同皮结合态多酚的总抗氧化力在12.19～38.24mgGAE/gDW之间，其中三白甜皮渣的最强，三白甜全皮的最弱。

综合上述结果，三白甜外皮的游离态多酚和三白甜皮渣的结合态多酚在4种抗氧化能力指标测定中均表现为能力最强，并且样品的抗氧化能力排序与其酚类成分含量排序呈现一定的相似性。因此进一步做了相关性分析。

表2 供试品种各石榴皮粉的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of different peel powers of the tested pomegranate cultivars

2.5 相关性分析

表3 皮粉样品游离态酚类组分含量与抗氧化能力间的相关性Table 3 Correlation between the free phenolic components andantioxidantactivity of the peel power samples

皮粉中游离态酚类与抗氧化能力之间的相关性见表3。可以看出，游离态单宁含量与各抗氧化指标均有极显著相关性，所以，游离态单宁含量是影响石榴皮游离态多酚提取物抗氧化能力的最主要因素。

表4 皮粉样品结合态酚类组分含量与抗氧化能力间的相关性Table 4 Correlation between the bound phenolic components and antioxidantactivity of the peel power samples

皮粉中结合态酚类与抗氧化能力间的相关性见表4。可以看出，结合态多酚、黄酮和单宁含量均与各抗氧化指标具有极显著相关性，其中结合态多酚和这些指标的相关系数相对最高，说明它们都是影响石榴皮结合态多酚提取物抗氧化能力的重要因素，其中结合态多酚含量是最重要的因素。

2.6 品种、皮粉类别和品种×皮粉类别互作对石榴皮提取物多酚含量的影响

根据品种、皮粉类别和品种×皮粉类别互作对石榴皮酚类物质含量影响的方差分析结果，可得出它们对酚类物质含量变化的影响率，如表5所示。

表5 品种、皮粉类别和品种×皮粉类别互作对石榴皮粉酚类物质含量方差的影响率（%）Table 5 The variance contribution percentage of cultiva，kind of peel powder，and their interaction on the total variance of polyphenols content（%）

由表5可以看出，品种、皮粉类别和品种×皮粉类别互作对游离态和结合态的多酚、黄酮和单宁的含量均有显著性的影响（p＜0.01），其中皮粉类别的影响作用最大，影响率在67.53%～80.17%之间，说明全皮、内层皮、外层皮和皮渣的各类多酚含量都有显著差别。显然，如果实际原料石榴果实无伤、无裂痕和表面污染小，全皮将是提取皮多酚的最佳原料。如果石榴果实有伤、有裂痕和表面污染较高，内层皮将是提取皮多酚的最佳原料。如果石榴果汁、果酒加工中形成了皮渣，皮渣也可用于提取多酚。但三种提取物的多酚含量和组成有一定差异。石榴栽培品种也会对其含量和组成造成差异。

关于皮渣与其他皮粉的酚类含量的差异，可以分析出如下原因：鲜石榴皮中含有70%～90%的水分，而游离态多酚的大部分成分均易溶于水，在石榴皮的压榨过程中，相当一部分游离态多酚已随皮汁流出，而不易水溶的结合态多酚得到了富集，故在剩余的皮渣中游离态多酚的含量较低，而结合态多酚的含量远高于其他组。

3 结论

游离态多酚为石榴皮多酚中的主要成分，结合态多酚约占石榴皮多酚的4%～20%。石榴皮渣中游离态多酚含量低于果皮，但结合态多酚含量高于果皮。内层皮各成分含量与外层皮有所差异。石榴皮各部位的游离和结合态酚都表现出较强的抗氧化能力。酚类成分和抗氧化能力之间有显著的相关性。品种、皮粉类别和品种×皮粉类别互作对游离态和结合态的多酚、黄酮和单宁的含量均有显著性的影响，其中皮粉类别是最主要的影响因素。

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Study on the com position and antioxidant activity of free and bound polyphenols in pomegranate peel

YUAN Tian，LIU Lin-wei*，GAO Zhong-mei，ZHAO Bei-ta
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China）

Ob jec tive：To ascertain the contents，com positions and antioxidantac tivities of the free and the bound polyphenols of pomeg ranate peel for p rovid ing theoreticalbasis of extraction and utilization.Methods：Four kinds ofpeelpowerwere p repared from pomegranate fruits of3 cultivars respectively.Their free and bound polyphenols were extracted w ith ultrasonic-assisted extrac tion method，and caustic stripp ing method respectively.The polyphenol contents and com positions of the extracts were determ ined by 3 methods.The antioxidant activities of them were assayed by 4 methods.Results：The total polyphenol，total flavonoid，and total tannin contents of the free polyphenol extracts were in the ranges of 107.55～157.60mg GAE/gDW，24.24～44.54mgQUE/gDW and 143.03～231.44mgTAE/gDW respectively.The total polyphenol，total flavonoid，and total tannin contents of the bound polyphenol extracts were in the ranges of 7.35～30.89mgGAE/gDW，2.25～11.56mgQUE/gDW and 9.01～18.86mg TAE/g DW respectively.The polyphenol compositions ofwhole peel，outer peel，inner peel，and juicing marc ofwhole peelpowers were significantly d ifferentw ith each other（p＜0.05），and the power of juicing marc of whole peel had the lowest free polyphenols content and the highest bound polyphenols content among them. Meanwhile，the compositions of the extracts from same kind of peel power from the 3 cultivars were also significantdifferent，which reflected the im pactof the cultivarwas also significant.In add ition，the free polyphenol extract from any peel power had sim ilar antioxidant capacity w ith the bound polyphenol extract from the same peelpower.And the antioxidant capacity were in consistent significantly w ith both the total polyphenol contents and the total tannin contents of the extracts（p＜0.01）.Conc lusion：The raw material using for extracting pomeg ranate fruit peel polyphenols could be chosen from whole peel，the inner peel or the marc of peel accord ing to their actual reserves and hygiene situation.Extraction of the free polyphenols could getmost part of the polyphenols in the material.The antioxidant potentialof the bound polyphenols of pomegranate peelwas sim ilar w ith the free ones at same dose，but the bound polyphenols contentof peelwas very lower generally.

pomeg ranate peel；free polyphenol；bound polyphenol；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002-0306（2014）18-0161-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.026

2014－01－02 *通讯联系人

原田（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品营养化学。