超声波辅助提取牛睾丸中精蛋白工艺优化

李若绮，韩 玲，*，李儒仁，韩广星，左秀峰，余群力，安迈瑞

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.山东绿润食品有限公司，山东临沂276000）

超声波辅助提取牛睾丸中精蛋白工艺优化

李若绮1，韩 玲1，*，李儒仁1，韩广星2，左秀峰2，余群力1，安迈瑞1

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.山东绿润食品有限公司，山东临沂276000）

以牛睾丸为原料，确定超声波辅助法提取牛睾丸精蛋白的最优工艺条件。实验采用Box-Behnken设计模型确定最佳提取条件为：硫酸浓度5.5%、超声波功率190W、提取时间10min，牛睾丸精蛋白产率为4.19%，精蛋白含量为66.70μg/g，产率比硫酸提取法提高了33.87%，提取时间缩短至10min，蛋白质含量增加了6.47μg/g，选择95%的乙醇作为沉淀剂时，乙醇体积比1∶3时，所得精蛋白粗品的产率、水溶性和色泽均最佳。

响应面法，超声波辅助提取，牛睾丸精蛋白

精蛋白（Protam ine）是一种多聚阳离子碱性天然抗菌肽类，一般由30～50个氨基酸组成，主要以精氨酸为主。常与DNA结合，其中DNA含量约占总量2/3，精蛋白占总量1/3[1-4]。精蛋白在临床上具有提高肝功能、助呼吸、促消化、降血压、抑制肿瘤生长等作用及治疗糖尿病等功能[5]。许多种动物成熟精巢组织中均可提取到精蛋白，并就其作用及基因序列进行了大量研究[6]。近年来，人们日益关注它的另一项作用，即精蛋白可作为增味剂、调味剂、防腐剂，广泛应用于诸如米饭、中华面、炒面、馒头、饺子等淀粉类食品中，还可与醋酸钠、甘氨酸、乙醇等复配后用于蛋糕、糊状食品[7-9]。

精蛋白提取通常利用大多数蛋白质不溶于NaCl（0.14mol/L）但溶于硫酸的原理，将大部分蛋白质沉淀溶解，进而利用有机溶剂降低溶液介电常数，增加蛋白质分子间不同电荷吸引力，使精蛋白在有机溶剂中沉淀析出[10]。超声波辅助提取法较上述提取方法，在提取过程中加入了超声波处理工序，降低了蛋白质变性失活几率，且超声波作用均匀，因而得到目的产物较快、较纯。

目前，人们已提取的动物精蛋白，主要来源于鱼类，而对哺乳动物精蛋白提取工艺的相关报道较少。作为畜产业生产大国，我国肉牛生产总量位居世界前列。随着肉牛养殖业迅猛发展，副产物也随之大量增加，而大部分的副产物都被浪费。因此，利用脏器资源，提取牛睾丸精蛋白具有十分重要的意义。本实验通过在单因素基础上进行响应面实验设计，对牛睾丸精蛋白得率进行分析，研究牛睾丸精蛋白的最佳提取方法及提取工艺参数，为精蛋白提取及其产业化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛睾丸 山东绿润食品有限公司，用水洗清洁后除去附着在睾丸上的脂肪、结缔组织、血块和污物等，将处理过的样品于-80℃下冻藏待用；氯化钠、浓硫酸、三氯乙酸、乙醇、丙酮、乙醚、异丙醇 上述所用试剂均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司。

JY92-ⅡDN型超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；756P型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FA1204B型电子天平 上海佑科仪表有限公司；JJ-2B型组织捣碎匀浆机 金坛市医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 主要工艺流程

1.2.2 实验方法 准确称取100g解冻的牛睾丸，置于组织捣碎机中，加入200m L的NaCl（0.14mol/L）溶液匀浆1min，冰浴搅拌20min后静置10min。所得匀浆液离心（4000r/m in，0℃，10m in），弃去上清液，所得沉淀即脱氧核糖核蛋白（DNP）[11]。在提取的脱氧核糖核蛋白中加入一定量不同浓度的硫酸溶液，进行超声波辅助提取牛睾丸精蛋白[12]，提取后离心（4000r/min，0℃，10m in），分离上清液，所得沉淀加入上述硫酸溶液重溶后重复上述操作一次，将两次操作的上清液合并，加入有机溶剂冰浴沉淀30m in后离心10m in（8000r/min，0℃），所得沉淀用丙酮洗涤2次，乙醚洗涤1次后真空干燥，得牛睾丸精蛋白。

1.2.4 精蛋白含量检测 采用考马斯亮蓝蛋白质含量测定法[13]。

1.2.5 超声波辅助提取牛睾丸精蛋白的单因素实验

1.2.5.1 超声波辅助提取牛睾丸精蛋白硫酸浓度的确定 分别配制不同浓度的硫酸溶液（2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%），按照1.2.2操作要求在提取的脱氧核糖核蛋白中加入硫酸溶液，用200W超声提取精蛋白30m in，加入有机溶剂沉淀离心制取牛睾丸精蛋白。

1.2.5.2 超声波辅助提取牛睾丸精蛋白超声波功率的确定 配制浓度为7.5%的硫酸溶液，设置超声波功率为：100、200、300、400、500、600W，提取时间30m in，采用1.2.2方法制取牛睾丸精蛋白。

1.2.5.3 超声波辅助提取牛睾丸精蛋白提取时间的确定 配制浓度为7.5%的硫酸溶液，设置超声波功率为400W，提取牛睾丸精蛋白方法同1.2.2，其中提取时间分别为10、20、30、40、50、60m in。

1.2.6 超声波辅助提取牛睾丸精蛋白的优化在单因素实验的基础上，选取硫酸浓度、提取时间和超声波功率为实验因素，以精蛋白得率为响应值，采用Box-Behnken设计模型对超声波辅助提取牛睾丸精蛋白的参数进行优化，共设计实验17组，每组做三个平行，利用Design-Expert 8.05b软件对实验数据进行分析处理，以获得最佳参数。每一个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。实验因素水平编码表见表1。

表1 因素水平编码Table 1 Chartof coding factors

1.2.7 沉淀剂的筛选在1.2.2实验中，分别以不同体积比（1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4）的乙醇（95%）、丙酮、三氯乙酸（60%）、异丙醇作为沉淀剂沉淀牛睾丸精蛋白。以精蛋白产率、所得产品溶解性、色泽为指标，选择出最佳沉淀剂和沉淀剂最佳用量。

1.3 数据处理

使用M icrosoft Excel和Design Expert进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 硫酸浓度对精蛋白产率影响 由图1可知，在超声波功率300W、提取时间为20min的条件下，随着硫酸浓度从2.5%增加到12.5%，精蛋白产率先快速上升后缓慢下降，且在5%时产率最高为3.54%；硫酸浓度过低时，结合精蛋白少，生成精蛋白硫酸盐少，提取不完全，而硫酸浓度过高时，蛋白质可能被部分水解；硫酸浓度在12.5%后，精蛋白产率会更低。由此，初步确定硫酸浓度范围为2.5%～10%。

图1 硫酸浓度对牛睾丸精蛋白产率的影响Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on testicular productivity

2.1.2 超声波功率对产率影响 由图2可知，在硫酸浓度为5%、提取时间为20min的条件下，随着超声波功率从100W增加到300W，精蛋白产率先上升后下

降，且当功率达到200W时精蛋白产率最高为3.67%，这是因为超声波的空化效应和机械效应会促进溶剂向精蛋白表面扩散，促进精蛋白硫酸盐的生成，但随着功率的增大可能会引起部分蛋白质的降解，而且对于特定的物质，超声作用的效果取决于超声频率和提取物的结构与性质，不同的提取物有不同适宜的提取超声功率；功率在400W处精蛋白产率略有上升，但不明显。据此初步确定超声波功率范围为100～400W。

图2 超声波功率对牛睾丸精蛋白产率的影响Fig.2 Effectof ultrasound power on testicular productivity

2.1.3 提取时间对产率影响 由图3可知，在硫酸浓度为5%、超声波功率300W的条件下，随着提取时间从10m in增加到60m in，精蛋白产率先上升后持续下降，且在提取时间20m in达到最大值为3.58%，下降趋势在提取时间为40m in后趋于平缓，这是因为绝大多数的精蛋白都在20m in内被提取出来，随着时间进一步的延长部分蛋白质会溶解。综合考虑经济和效率等因素，初步确定提取时间范围为10～40m in。

图3 提取时间对牛睾丸精蛋白产率的影响Fig.3 Effectof extraction time on testicular productivity

2.2 超声波提取工艺参数优化

采用Box-Behnken设计模型能用较少的实验次数进行全面的分析研究[14-17]。以硫酸浓度、提取时间和超声波功率为实验因素，以精蛋白产率为响应值，各实验因素水平编码如表1所示，共实施17组响应面分析实验。用Design-Expert 8.05进行数据处理分析，各组实验列表及产率见表2。

2.2.1 回归模型建立及检验 实验结果表示，精蛋白产率在3.7%～4.3%之间。借助Design-Expert 8.05软件对所得实验结果进行分析，获得对牛睾丸精蛋白产率Y的二次回归模型为：

表2 响应面分析结果Table 2 Results of response surface analysis

上述二次回归模型进行方差分析和回归系数显著性检验，结果如表3所示。

由表3方差分析可知，回归模型的p＜0.01，表明回归模型极其显著；失拟项p＞0.05，失拟不显著，说明模型所拟合的二次回归方程与实际相符合，能正确反映牛睾丸精蛋白产率Y与X1、X2和X3之间的关系，回归模型可以较好地对优化实验中各种实验结果进行预测。

2.3 各因素对性能指标的影响分析

2.3.1 硫酸浓度和超声波功率对精蛋白产率的影响

令X3=0，得硫酸浓度X1和超声波功率X2与精蛋白产率Y之间的偏回归方程为：

Y=3.565+0.22X1+8.61111×10-4X2+1.33333× 10-4X1X2-0.022756X12-4.22222×10-6X22

图4 硫酸浓度和超声波功率对应精蛋白产率的响应面图Fig.4 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and ultrasonic power

由图4可以看出，硫酸浓度由2.5%向7.0%变化时，

精蛋白产率不断增大，且上升趋势较明显。当硫酸浓度固定在某一水平时，随超声波功率的增加（100～400W），精蛋白产率变化不大。由此说明在硫酸浓度变化不大时，精蛋白产率对于在一定范围内超声波功率的变化不很敏感。由偏回归分析和方差分析可知，硫酸浓度对精蛋白产率的影响大于超声波功率。

表3 回归模型方差分析及显著性检验Table 3 Results of ANOVA

2.3.2 硫酸浓度和提取时间对精蛋白产率的影响 令X2=0，得硫酸浓度X1和提取时间X3与精蛋白产率Y之间的偏回归方程为：

图5 硫酸浓度和提取时间对应精蛋白产率之间的响应面图Fig.5 Response surface graph of testicular productivity between sulfuric acid concentration and extraction time

由图5可以看出，提取时间由10m in向40m in变化时，精蛋白产率变化不大。当提取时间固定在某一水平时，随硫酸浓度的增加，精蛋白产率明显先快速上升（2.5%～6.0%），然后下降（6.0%～10%）。由此说明在提取时间变化不大时，精蛋白产率对于在一定范围内硫酸浓度变化非常敏感。由方差分析和偏回归分析可以得出，硫酸浓度对精蛋白产率的影响大于提取时间。

2.3.3 超声波功率和提取时间对精蛋白产率的影响

令X1=0，得超声波功率X2和提取时间X3与精蛋白产率Y之间的偏回归方程为：

图6 提取时间和超声波功率对应精蛋白得率之间的响应面图Fig.6 Response surface graph of testicular productivity between ultrasonic power and extraction time

由图6可以看出，超声波功率由80W向200W变化时，精蛋白产率不断增大，且上升趋势较明显，从200W开始到600W时，产率随着超声波功率增加而快速降低。当超声波功率固定在某一水平时，随提取时间的增加，精蛋白产率出现下降趋势。由此说明，精蛋白产率对一定范围内超声波功率变化和提取时间变化都较为很敏感。由方差分析和偏回归分析可以得出，超声波功率对精蛋白产率的影响大于提取时间。

2.4 最优作业参数确定及模型验证

通过对回归方程模型进行优化求解，以精蛋白产率最大值（4.21%）作为相应结果，从Design Expert软件中可得到超声波辅助牛睾丸精蛋白提取最优工艺参数为：硫酸浓度5.48%、超声波功率188.54W和提取时间10m in。3个因素对牛睾丸精蛋白产率影响主次顺序为：硫酸浓度、超声波功率和提取时间。

为了进一步为了验证模型的可靠性，采用响应

面所得最优条件的调整参数（硫酸浓度5.5%、超声波功率190W，提取时间10min）进行精蛋白提取实验。从表4可以看出，两种方法提取牛睾丸精蛋白后产率分别为3.13%、4.19%，蛋白含量分别为60.23、66.70μg/g。该产率与Design Expert模拟结果相比，相对误差为0.24%。同硫酸提取实验中最优结果相比，产率相对提高了33.87%，提取时间缩短至10m in。因此，通过响应面实验设计得到的牛睾丸精蛋白提取工艺参数准确可靠，可用于实际操作。

表4 牛睾丸中精蛋白含量及产率Table 4 Testicular productivity and content in bovine testis

2.5 沉淀剂的筛选

2.5.1 沉淀剂种类选择 分别用乙醇（95%）、三氯乙酸（60%）、异丙醇、丙酮沉淀牛睾丸精蛋白，所得精蛋白粗品的产率、水溶性和色泽见表5。

表5 不同沉淀剂效果比较Table 5 Results of precipitation using different reagent

从表5可以看出，以产率而言，95%乙醇、60%三氯乙酸的产率较高，其中以60%三氯乙酸为沉淀剂的产率最高。从溶解性来看，以丙酮、60%三氯乙酸、为沉淀剂所得产品的溶解性不好，难溶解，有沉淀。综合考虑，选择95%乙醇作为沉淀剂。

2.5.2 沉淀剂95%乙醇用量确定 由图7可知，95%乙醇体积比为1∶1、1∶1.5、1∶2时，精蛋白产率在3%以下，当沉淀剂体积比增加到1∶2.5时，产率为3.28%；当沉淀剂的体积比为1∶3时，精蛋白产率最高为4.2%；随着沉淀剂体积比的增加，牛睾丸精蛋白粗品的产率缓慢下降。所以选择体积比为1∶3的95%乙醇作为沉淀剂来沉淀牛睾丸精蛋白。

图7 不同体积比对应牛睾丸精蛋白产率Fig.7 Testicular productivity using different volume ratio in bovine testes

3 结论

经过上述实验和统计分析，本实验所得出结论如下：

3.1 结合Box-Behnken实验设计原理，采用响应面分析方法，进行超声波辅助提取牛睾丸精蛋白工作参数优化，通过实验优化结果可得影响精蛋白产率的因素由大到小依次为：硫酸浓度、超声波功率和提取时间。

3.2 由回归模型得出超声波辅助法提取牛睾丸精蛋白最佳工艺参数为：硫酸浓度5.48%、超声波功率188.54W和提取时间10m in，实际操作选择硫酸浓度为5.5%、超声波功率为190W，提取时间10m in。

3.3 超声波辅助法提取牛睾丸精蛋白优于硫酸提取法，超声波辅助法比硫酸提取法产率提高了33.87%，提取时间缩短至10m in，蛋白质含量增加了6.47μg/g。

3.4 以95%乙醇作为沉淀剂来沉淀牛睾丸精蛋白，当乙醇体积比为1∶3时，精蛋白产率最高。

综上所述，本实验确定了超声波辅助法提取牛睾丸精蛋白优化工艺参数，为精蛋白工业化生产提供了理论依据。

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Optimization of ultrasonic assistant protamine extraction processingparameters using response surface methodology in bovine testes

LIRuo-qi1，HAN Ling1，*，LIRu-ren1，HAN Guang-xing2，ZOU Xiu-feng2，YU Qun-li1，AN Mai-rui1
（1.College of Food Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Shandong Lorain Food Company，Linyi276000，China）

Experiments of extracting protamine with ultrasound assistant processing in bovine testes weredesigned using Box-Behnken response surface methodology. The optimal extraction processing parametersbased on design expert were：5.5% sulfuric acid，190W of ultrasonic and extraction time was 10min. Comparedwith the traditional extraction method，this study raised the protamine productivity up to 33.87%，decreased theextraction time to 10min and increased the content of protamine with up to 6.47μg/g as well. In addition，whilethe optimal precipitating reagent was 95% ethanol，volumeration 1∶3 for testicular precipitation，protamine productyield，water soluble and color were the best.

response surface methodology；ultrasonic assistant；testicular protamine

S872

：B

：1002-0306（2014）16-0212-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.039

2013-11-06 *通讯联系人

李若绮（1987-），女，硕士研究生，研究方向：畜产品加工。

国家现代农业产业技术体系项目资助（CARS-38）；国家公益性行业（农业）科研专项经费资助（201203009）。