一起鸡传染性鼻炎疫情的病原鉴定

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（1.长沙市动物卫生监督所，湖南长沙 410013；2.长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410013）

一起鸡传染性鼻炎疫情的病原鉴定

王洪亮1，2，颜克旭2，王辉2

（1.长沙市动物卫生监督所，湖南长沙 410013；2.长沙市动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410013）

鸡传染性鼻炎是由副鸡嗜血杆菌引起鸡的急性呼吸系统疾病。主要症状为鼻腔与窦发炎，流鼻涕，脸部肿胀和打喷嚏。其传播途径主要以飞沫及尘埃经呼吸传染，但也可通过污染的饲料和饮水经消化道传染。本文对一存栏量达2万羽的规模鸡场发生传染性鼻炎进行了临床观察、细菌分离鉴定以及病例复制，最后就该鸡场传染性鼻炎的发生及防控进行了分析。

鸡传染性鼻炎；病原；鉴定；分析；PCR

1 材料与方法

1.1 病料及实验用鸡

来自湖南某鸡场的10只发病鸡。病例复制用实验鸡4只，购自湖南某未进行过传染性鼻炎疫苗接种且未出现过传染性鼻炎疫情的鸡场。

1.2 主要试剂

Taq plus DNA polymerase购自北京天根生化科技有限公司，dNTP、DL2000 DNA Marker购自大连宝生物科技有限公司，巧克力培养基购自郑州贝瑞特生物技术有限公司。

1.3 发病鸡的临床以及解剖观察

将送检病鸡进行临床表现观察后，按常规方法处死，并进行解剖、观察、采样。

1.4 细菌分离以及显微镜检查

从采集的病鸡鼻腔、脾脏、肺脏、肾脏无菌钩取样本，分别划线接种巧克力培养基后放于烛缸进行培养，37℃培养48h后观察细菌生长情况。细菌分离培养操作完成后取鼻腔液、脾脏、肺脏、肾脏、触片，用姬姆萨染色镜检。

1.5 细菌培养物的镜检及PCR鉴定

挑取形态上具有代表性的单个菌落进行革兰染色镜检和16sR DNA的PCR扩增。PCR扩增采用细菌通用引物进行，引物资料见文献[1]，PCR方法按常规操作，并于PCR扩增后将产物送上海铂尚生物技术有限公司进行测序鉴定。

1.6 分离细菌的药物敏感性检测

取分离的可疑病原菌扩大培养后，用纸片法进行药物敏感性检测。

1.7 病例复制

取扩大培养的可疑病原细菌，滴鼻接种100日龄左右的三黄鸡2只作为试验组，另饲养2只作为对照组。试验组于购进后第3天每只鸡滴鼻2.3×108个细菌，对照组隔离饲养并同步滴鼻生理盐水处理。

2 结果

2.1 发病鸡的临床和解剖观察结果

通过临床观察发病鸡，可见病鸡有甩头现象，多数表现一侧眼睛肿大失明，有1只鸡双侧眼睛失明以及面部肿大（见图1），其他未见到有异常表现。按常规方法将病鸡处死，解剖发现，心、肝、脾、肺脏、气囊、肾脏以及嗉囊、腺胃、肌胃、肠道等均没有明显病变，但病鸡鼻腔充满浓稠的粘液（见图2），1只鸡面部皮下有水肿。

图1病鸡眼睛失明面部肿大

图2病鸡鼻腔浓稠的粘液

2.2 细菌显微镜检结果

从采集的病鸡鼻腔、脾脏、肺脏、肾脏无菌钩取样本，接种巧克力培养基，结果仅在鼻腔粘液接种的平板上长出了2种形态的细菌（见图3）。取病鸡心血、肝、脾、肺脏、鼻咽部粘液触片镜检，结果心血、肝、脾、肺脏触片没有观察到细菌，但在鼻咽部粘液见到聊杆状细菌存在（见图4）。

图3鼻腔液细菌生长情况

图4鼻腔液触片镜检结果

2.3 细菌培养物显微镜检结果及PCR扩增测序结果

挑取形态上具有代表性的单个菌落进行革兰染色镜检结果发现平皿表面白色大菌落为革兰阳性球菌，根据形态观察确定为葡萄球菌。平皿表面大量的小菌落镜镜检为革兰阴性的小杆菌，最后取小菌落进行16sR DNA的PCR扩增、测序，测出序列按菌株命名为2LY（序列GeneBank登录号为KF530284）以及序列的同源性比较分析（见图5），发现小菌落16sR DNA与GeneBank登录的副鸡嗜血杆菌同源性最高，与其中登录号GU951543的副鸡嗜血杆菌同源性达到99.4%。

图5分离菌16sR DNA与GeneBank登录序列同源性比较结果（2LY为分离菌序列）

2.4 药物敏感性检测结果

取分离的副鸡嗜血杆菌扩大培养后，用纸片法进行药物敏感性检测，结果见表1，由表1可见该分离菌对头孢噻吩、氯霉素、环丙氟哌酸、以及卡拉霉素敏感，但对链霉素、强力霉素、以及青霉素不敏感。

表1 各组发病率与死淘率

2.5 病例复制结果

取扩大培养的副鸡嗜血杆菌，滴鼻接种100日龄左右的三黄鸡，结果实验组在滴鼻后4天表现出有甩头、尖叫症状，第6天表现出张口呼吸现象（见图6），第8天试验组中1只发病鸡出现死亡，另1只鸡于发病后10天自愈，临床症状消失；对照组没有任何异常表现。取死亡的试验鸡，进行细菌分离鉴定，从病鸡鼻腔深部分离到了大量的副鸡嗜血杆菌。

图6呈张口呼吸的试验鸡

3 小结

本文从发病鸡分离到2种形态的细菌，通过形态学观察、PCR测序鉴定将2种细菌分别鉴定为葡萄球菌和副鸡嗜血杆菌。最后通过可疑病原菌的动物回归试验证明副鸡嗜血杆菌为该次鸡群发病的病原菌，并通过药敏试验对分离的副鸡嗜血杆菌的药物敏感性进行了检测，发现该分离菌株对头孢噻吩、氯霉素、环丙氟哌酸药物非常敏感。鸡场通过选用敏感药物有效的控制了疫情，为鸡传染性鼻炎的诊断以及防控提供了参考[2-3]。

鸡传染性鼻炎的发生与一些能使机体抵抗力下降的诱因密切有关[4]。如鸡群拥挤，不同年龄的鸡混群饲养，通风不良，鸡舍内闷热，氨气浓度大，或鸡舍寒冷潮湿，缺乏维生素A，受寄生虫侵袭等都能促使鸡群严重发病[5]。该鸡场鸡群采取分层饲养的方式进行，鸡舍内鸡群整体密度较大，加上7月份天气炎热，所以鸡群表现出了明显的临床发病症状。

[1] Run C L， Chao T X， Xing Q， et al. Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Masked Palm Civet （Paguma larvata） Journal of Animal and Veterinary Advances， 2012，11（12）：2020-2023.

[2] 朱子洁，汪春雪，梁武. 鸡传染性鼻炎的综合防制[J]. 兽医导刊，2010，32（12）：21-23.

[3] 钱凤芹，庄文忠，任红梅，等.鸡传染性鼻炎及其防制[J].中国动物保健，2001，30（4）：27-29.

[4] 苗得园，孙惠玲，陈晓峰，等.副鸡嗜血杆菌的分离鉴定及我国鸡传染性鼻炎的流行状况分析[J].中国预防兽医学报，2006，29（4）：31-35.

[5] 陈宝利，郭伶.鸡传染性鼻炎的血清型调查及鉴定[J].中国畜牧兽医，2007，37（1）：41-43.

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