肝细胞癌弥散加权成像与肿瘤血管生成的相关性*

1.郫县人民医院放射科(四川 成都 611730)

2.川北医学院附属医院放射科(四川 南充 637000)

3.陕西中医学院二附院MR室(陕西 712000)

陈 红1 郭长义3 杨 林2熊义富2 张绍金1 徐其显1

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其治疗仍是临床面临的难点。要提高HCC的诊治水平，必须深入了解其生物学特征。国内、外相关研究[1,2]发现，肿瘤血管生成对肿瘤的生长及预后具有重要作用。

磁共振弥散加权成像(Diffusion weighted imaging,DWI)使影像对人体的研究深入到分子水平。DWI不仅能反映组织的弥散特性，还能够对组织、器官的微观结构和功能变化进行定量分析[3]。近年来，国内外学者运用DWI对肝脏疾病(尤其是良恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断)进行了相关研究[4,5]。关于表观弥散系数(Apparent diffusion coefficient,ADC)值与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、微血管密度(microvessel density,MVD)的相关性报道少见。本研究的目的在于探讨HCC的ADC值与肿瘤血管生成的相关性，希望能够从分子生物学水平研究HCC与影像学的关系。

1 对象与方法

1.1 对象2007年7月至2011年7月川北医学院附属医院确诊的HCC患者共38例，其中男31例，女7例，年龄25～70岁，平均51.39±11.69岁。

1.2 方法

1.2.1 纳入标准：手术切除，术前未行抗癌治疗，术前行DWI扫描，病理证实的HCC患者。

1.2.2 MRI扫描：检查当天禁食12小时，禁水8小时。采用1.5T超导性磁共振扫描仪(GE公司产品)，行常规T1WI(图1)、T2WI(图2)及DWI(图3)检查。

1.2.3 图像选择及ADC值的测量：由两位具有副教授以上职称的MR医师共同完成图像质量评估。选取合格的图像，根据T2WI显示的病灶范围，由相应层面DWI图像经后处理工作站(DW4.4)拟合成ADC伪彩图(图4)。在肿瘤直径最大的层面上选取3个感兴趣区(Region of interest,ROI)，ROI尽量包含肿瘤实性部分的最大范围，同时避开瘤内坏死区、血管及胆管等。在计算机软件下完成ADC值的测量，并取其平均值。

1.2.4 全部标本在病理专家阅片后认定，并根据Edmondson-Steiner分级法确定细胞分化程度(图5)，其中高分化(Ⅰ级)20例，中分化(Ⅱ级)10例，低分化(Ⅲ～Ⅳ级)8例。

1.2.5 免疫组化主要步骤(Elivison法)：福尔马林固定标本后取材，脱水，包埋，切片(厚3μm)。首先滴加3%H202(过氧化氢)，然后将VEGF、CD31置于pH=6.0的EDTA液中，再滴加第一抗体，再依次滴加增强剂、聚合物、新鲜配制DAB(二氨基联苯胺)，显微镜下观察，复染，返蓝，脱水，透明，封片，镜检。

1.2.6 VEGF(图F)表达判定方法参考文献[6]，并稍作改进：细胞的胞浆呈棕黄色或棕褐色为阳性。低倍镜下选择“热点”(hotspot)，即VEGF阳性细胞分布较密集的区域，高倍镜(×400)下，计数5个“热点”视野。根据细胞染色分为3级(1级：阴性；2级：弱阳性，3级：阳性及强阳性)，阴性(-)：染色细胞数＜5%；弱阳性(+)：5%～25%；阳性(++)：26%～50%；强阳性(+++)：＞50%。

表1 HCC组织VEGF与ADC值的相关性

表2 HCC组织MVD与ADC值的相关性

表3 HCC细胞分化与ADC值的相关性

1.2.7 MVD(图G)计数方法[7]：低倍镜下找到“热点”，即微血管最密集的区域，400倍高倍镜下进行计数。任何染成棕黄色，且与邻近微血管、肿瘤细胞和其他结缔组织分界清楚的内皮细胞或内皮细胞簇，作为一个计数。计数5个“热点”，取其均值作为MVD计数，以-“均数±标准差(X± S)”表示，以量化CD31表达水平。

1.3 统计学分析计量资料均以“均数±标准差(±S)”或“几何均数(G±S)”表示，多个样本检验采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验。相关分析采用Pearson或Spearman秩相关检验。检验标准α=0.05。所有统计学处理均采用SPSS11.5软件完成。

2 结 果

2.1 HCC组织VEGF与ADC值的相关性HCC的VEGF表达为1级，2级，3级组所对应的ADC值分别为1.17±0.49×10－3mm2/s、1.46±0.45×10－3mm2/s、0.91±0.47×10－3mm2/s，VEGF1级与2级、1级与3级组ADC值不具有统计学意义(p=0.182，p=0.198)；2级与3级组具有显著差异(p=0.003)。HCC的VEGF与ADC值显著相关(r=-0.321，p=0.05)(表1)。

2.2 HCC组织MVD与ADC值的相关性38例HCC组织MVD的(G±S)为(1.52±0.30)×400，ADC值的(X±S)为1.15±0.51×10-3mm2/s，两者间无显著相关(r=-0.158，p=0.345)(表2)。

2.3 HCC细胞分化与ADC值的相关性38例HCC按细胞分化程度分为高、中、低分化三组。三组ADC值分别为0.92±0.51×10-3mm2/s、1.33±0.34×10-3mm2/s、1.52±0.46×10-3mm2/s。高分化和中、低分化组ADC值有显著差异；中分化与低分化无显著差异。HCC病理分级与ADC值显著相关(r=0.530，p=0.001)(表3)。

43岁，男性，病变位于肝右叶图1为T1WI，病灶呈低信号(白色箭头)；图2为T2WI，病灶呈稍高信号(白色箭头)；图3为DWI(b=300s/mm2)，病灶呈高信号(白色箭头)；图4为ADC伪彩图，ADC值为0.34×10-3mm2/s；图5为细胞分化，为高分化；图6为VEGF，呈强阳性 (++++)；图7为MVD；

3 讨 论

3.1 HCC组织ADC值与VEGF、MVD的相关性肿瘤血管生成在肿瘤的形成、发展及预后中具有重要作用，在促进肿瘤血管生成中，VEGF具有重要作用，且与肿瘤的浸润、转移关系密切[8,9]。

MVD可量化血管形成程度，间接反映肿瘤的生物学行为。研究表明[10]，肿瘤组织中MVD表达增加，肿瘤侵袭转移的能力也明显提高。由此可见，MVD与HCC的浸润及转移密切相关。

DWI利用生物体内水分子的布朗运动成像，并通过ADC值来反映生物体内水分子的扩散特性。目前关于ADC的研究结果不完全一致，这可能与样本含量、扩散敏感因子(Diffusion sensitzing factor，b值)的选择、b值的多少及微循环灌注有关[11]。一般认为[12-14]，当b值为300～800s/mm2可以获得较清晰的DWI图，肝脏及病灶的对比较好，受血流灌注的影响较小，所测得的ADC值更准确。

VEGF可以增加血管的通透性。我们假设VEGF能增加水分子的弥散能力，那么随着VEGF增加，病灶ADC值也应增加，即VEGF与ADC值呈正相关。我们的研究显示HCC的ADC值与VEGF显著负相关(r=-0.321，p=0.05)，与假设不完全一致。说明，虽然HCC的ADC值与血管生成具有相关性，但肿瘤血管生成的过程复杂，不能简单地用VEGF可以增加血管通透性来解释HCC的VEGF与ADC值的关系。

MVD被看作是评估血管生成状态的“金标准”，但也有不足，首先，有创，不能在活体上重复实施；其次，无法实时、动态观察肿瘤血管生成状况；再次，选取样本少，不能反映肿瘤整体；最后，由于肿瘤的异质性及病理检查的局限性，不易控制采样误差。本实验结果显示HCC的MVD与ADC值无显著相关。原因可能与上述MVD的局限性，ADC值测量方法，b值的选择等相关。

3.2 HCC组织ADC值与组织分化的相关性肝细胞癌细胞分化程度的判定是在Edmondson-Steiner分级系统的基础上进行的。E-S系统依据的是细胞不典型增生，由此导致细胞内环境的改变，从而改变ADC值。理论上，分化程度越低，ADC值也越低。我们的研究发现分化程度与ADC值之间显著相关(p=0.001)，说明ADC值与HCC的侵袭性相关。

本研究结果与文献[6]不完全一致，原因可能是：测量ADC的方法及b值不同；样本量少。本研究在ROI的选择上是尽量包含肿瘤实性部分的最大范围。弥散加权成像的分辨率有限，肝脏内的ROI直径应大于1.0cm，尽量包括病灶最大面积[13]。Heo[6]等选择的ROI为42个像素。其次是b值的选择，本研究采用b值为300s/mm2或500s/mm2，而Heo等选择b值为1000s/mm2。研究发现[14]，在b值为1000s/mm2时，病灶和肝实质信号都明显衰减、图像质量差，影响病灶的显示，从而影响ADC值测量的准确性。

4 结 论

ADC值与VEGF表达及病理分级显著相关，说明ADC值与肿瘤血管生成具有相关性；DWI可以用于评价HCC肿瘤血管生成。

本研究尚存在不足之处：①样本少，结果的可靠性需要进一步扩大样本量来验证。②HCC直径大于3cm，缺乏小肝癌的数据。③回顾性分析，DWI图像与手术标本不是完全对应，且我们测量ADC值是在肿瘤的最大层面，所得ADC值不能代表整体。④b值越多，测得的ADC与真实的ADC越接近，本研究中b值较少。⑤本实验主要研究ADC值与肿瘤血管生成的相关性，没有考虑HCC的强化程度、方式等因素的影响。⑥虽然ADC值与VEGF显著相关，但各组之间ADC值相互重叠。以上都可能造成实验结果的误差，也将是我们后期研究的目标。

1. Du JR, Jiang Y, Zhang YM,et al. Vascular endothelial growth factor and microvascular density in esophageal and gastric carcinomas [J]. World J Gastroenterol. 2003, 7(9):1604-1606.

2. Zijlmans HJ, Fleuren GJ,Hazelbag S, et al. Expression of endoglin (CD105) in cervical cancer [J]. Br J Cancer. 2009,100(10): 1617-1626.

3. Ren J, Liu H, Yan L, et al.Microvessel density and heparanase overexpression in clear cell renal cell cancer:correlations and prognostic significances [J].World J Surg Oncol. 2011, 9(1):158-165.

4. Martie1 A, Sporea1 I,Popescu1 A, et al. Contrast Enhanced Ultrasound for the characterization of hepatocellular carcinoma [J].Medical Ultrasonography. 2011,13(2): 108-113.

5. Otsuka H, Terazawa K, Morita N, et al. Is FDG-PET/CT useful for managing malignant pleural mesothelioma [J]. J Med Invest.2009, 56(1-2): 16-20.

6. Kele PG, van der Jaqt EJ.Diffusion weighted imaging in the liver [J]. World J Gastroenterol. 2010, 16(13):1567-1576.

7. Schellinger PD, Bryan RN,Caplan LR, et al. Evidencebased guideline: the role of diffusion and perfusion MRI for the diagnosis of acute ischemic stoke: report of therapeutics and technology assessment subcommittee of the american academy of neurology [J].Neurology. 2010, 75(2): 177-185.

8. Igarashi H. What stroke MRI provides to us [J]. Rinsho Shinkeigaku. 2007, 47(11): 921-924.

9. Mehdizade A, Somon T, Wetzel S, et al. Diffusion weighted MR imaging on a low-field open magnet. comparison with findings at 1.5T in 18 patients with cerebral ischemia [J]. J Neuroradiol. 2003, 30(1): 25-30.

10.Maniam S, Szklaruk J. Magnetic resonance imaging: Review of imaging techniques and overview of liver imaging [J]. World J Radiol. 2010, 2(8): 309-322.

11.Xu PJ, Yan FH, Wang JH, et al.Contribution of diffusionweighted magnetic resonance imaging in the characterization of hepatocellular carcinomas and dysplastic nodules in cirrhotic liver [J]. J Comput Assist Tomogr. 2010, 34(4):506-512.

12.Wybranski C, Zeile M, Lowenthal D, et al. Value of diffusion weighted MR imaging as an early surrogate parameter for evaluation of tumor response to high-dose-rate brachytherapy of colorectal liver metastases[J].Radiat Oncol. 2011, 6(1): 43-50.

13.Heo SH, Jeonq YY, Shin SS,et al. Apparent Diffusion Coefficient Value of Diffusion-Weighted Imaging for Hepatocellular Carcinoma：Correlation with the Histologic Differentiation and the Expression of Vascular Endothelial Growth Factor [J].Korean J Radiol. 2010, 11(3):295-303.

14.Shibusa T, Shijubo N, Abe S.Tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in stage I lung adenocarcinoma [J]. Clin Cancer Res.1998,4(6):1483-1487.

15.Wang JY, Lv FQ，Fei X, et al.Study on the Characteristics of Contrast-Enhanced Ultrasound and Its Utility in Assessing the Microvessel Density in Ovarian Tumors or Tumor-Like Lesions[J].Int J Biol Sci.2011,7(5):600-606.

16.Liang JF, Wang HK, Xiao H, et al. Relationship and prognostic significance of SPARC and VEGF protein expression in colon cancer [J]. J Exp Clin Cancer Res. 2010, 29(1): 71-81.

17.Naqv VM, Buiqa R, Brie I, et al. Expression of VEGF, VEGFR,EGFR, COX-2 and MVD in cervical carcinoma, in relation with the response to radio-chemotherapy[J]. Rom J Morphol Embrvol.2011, 52(1): 53-59.

18.Li SG, Ye ZY, Zhao ZS, et al. Correlation of integrin β3 mRNA and vascular endothelial growth factor protein expression profiles with the clinicopathological features and prognosis of gastric carcinoma [J]. World J Gastroenterol. 2008, 14(3):421-427.

19.Ding YB, Chen GY, Xia JG,et al. Association of VCAM-1 overexpression with oncogenesis, tumor angiogenesis and metastasis of gastric carcinoma [J]. World J Gastroenterol. 2003, 9(7):1409-1414.

20.Jiang HJ, Zhang ZR, Shen BZ,et al. Quantification of angiogenesis by CT perfusion imaging in liver tumor of rabbit [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2009, 8(2):168-173.

21.Cerase A, Lazzeretti L, Vallone IM, et al. Diffusion-weighted MRI of bone marrow oedema, soft tissue oedema andsynovitis in paediatric patients:feasibility and initial experience [J]. Pediatric Rheumatology. 2012, 103(4):299-311.

22.Dijkstra H, Baron P, Kappert P, et al. Effects of microperfusion in hepatic diffusion weighted imaging [J].Eur Radiol. 2012, 22(4): 891-899.

23.Thoeny HC, De Keyzer F.Diffusion-weighted MR imaging of native and transplanted kidneys [J]. Radiology. 2011,259(1): 25-38.

24.Jiang ZX, Peng WJ, Tang F,et al. Effect of b value on monitoring therapeutic response by diffusion-weighted imaging[J].World J Gastroenterol.2008, 14(38): 5893-5899.

25.Kandpal H, Sharma R, Gupta SD, et al. Solitary fibrous tumour of the liver: a rare imaging diagnosis using MRI and diffusion-weighted imaging [J].Br J Radiol. 2008, 81(972):282-286.

26.莫蕾,江新青,陈阿梅等.DWI对宫颈癌的诊断及与肿瘤细胞密度相关性的初步研究[J].中国CT和MRI杂志,2011,09(3):49-52.

27.易建玮,吴荣兴,康强等.常规MRI联合DWI对不同分化程度小肝癌的诊断价值[J].中国CT和MRI杂志,2013,11(3):14-16.

28.Kilickesmez O, Yirik G,Bayramoglu S, et al. Nonbreath-hold high b-value diffusion-weighted MRI with parallel imaging technique:apparent diffusion coefficient determination in normal abdominal organs [J]. Diagn Interv Radiol. 2008, 14(2): 83-87.

29.Taouli B, Tolia AJ, Losada M, et al. Diffusion-Weighted MRI for Quantification of Liver Fibrosis: Preliminary Experience [J].AJR Am J Roentgenol. 2007, 189(4): 799-806.

30.Bachir Taouli, Anuj J.Tolia1, Mariela Losada2,et al. Diffusion-Weighted MRI for Quantification of Liver Fibrosis: Preliminary Experience [J].AJR. 2007,189(4): 799-806.

31.Petra G Kele and Eric J van der Jagt. Diffusion weighted imaging in the liver[J]. World J Gastroenterol. 2010, 16(13):1567-1576.

32.苏勤.对人肝细胞癌前期病变的新认识(上),中国医刊,2006, 41(11).

33.刘文娟,董鹏,王滨,李玉意,崔慧.外生型肝细胞癌及肝血管瘤的CT诊断,中国中西医结合影像学杂志,2008,6(2).

(本文编辑: 汪兵)