番茄抗TYLCV基因新标记的开发及其在多抗聚合选择中的应用

胡 霞 王 蓉 李菲菲 周 涛 杨文才

（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）

自20世纪90年代我国发现番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）以来，该病害已遍布我国番茄主产区，严重威胁我国的番茄生产（叶青静 等，2009；李小靖和叶志彪，2010；李常保 等，2012；吴篆芳 等，2013）。尽管利用杀虫剂等方法能在一定程度上控制该病毒传播者——烟粉虱的数量，但是经常施用杀虫剂会使烟粉虱产生抗药性（Horowitz et al.，2007），也会造成严重的环境污染（Palumbo et al.，2001）。采用细孔网或者紫外吸收塑料膜遮盖等物理方法（Cohen ＆ Antignus，1994）起到了一定的防治效果，然而这些物理防治方法不能保证正常的光照，还会形成高温高湿的环境，影响番茄植株的正常生长。利用植物自身的抗性基因是防治TYLCV 最有效的方法（Morales，2001；Lapidot ＆Friedmann，2002）。

番茄在生长发育过程中除受到多种病毒侵染外，还会同时受到诸如斑点病、疮痂病和溃疡病等细菌性病害的危害，培育抗多种病害的品种一直是番茄育种的目标（杜永臣 等，1999）。采用常规育种方法难以在田间进行抗单一病害材料的筛选，分子标记辅助选择为解决这一难题提供了可能。Sun等（2011）根据番茄斑点病抗性基因Pto位点在抗感病材料中的序列差异建立的InDel 标记和Pei 等（2012）利用番茄疮痂病抗性基因Rx4位点在抗感材料中的序列差异建立的InDel 标记都是功能基因分子标记，能够对抗病个体进行准确的选择。而对于尚未克隆的抗性基因，则可选择与基因最紧密连锁的标记，以提高选择的准确性，如Yang 和Francis（2005）利用与番茄疮痂病抗性位点Rx3紧密连锁的标记成功地将Rx3和Pto两个基因聚合到同一材料中，育成抗番茄斑点病和疮痂病的材料。从1994年至今，人们已经开发了与5个抗TYLCV基因Ty-1～Ty-5紧密连锁的可用于抗性基因选择的分子标记（杨晓慧 等，2012），但这些标记在实际应用中都存在一些问题，如检测太复杂、稳定性和可靠性不高等。番茄基因组的出现以及抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3的克隆，为开发稳定可靠且检测简单易行的标记提供了可能。因此，本试验的目的是开发可用于准确选择Ty-1/Ty-3和Ty-4的分子标记，并将抗病毒病基因与抗细菌病害基因聚合，培育抗多个病害的育种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验用于标记辅助选择的番茄（SolanumlycopersicumL.）亲本有10个，OH 9242 和里格尔87-5 分别是美国和我国广泛种植的两个加工番茄品种，但缺少抗TYLCV 的基因；IBL 2361 和ZN 17是两个育种中间材料；另有6 份材料分别作为不同病害抗性基因的供体（表1）。将这些材料配制一些杂交组合，加代得到F2群体，供标记辅助选择用。

2013年6月28日将F2种子播种于288 孔育苗盘中，育苗基质为2V草炭∶1V蛭石。从幼苗上取幼嫩叶片提取DNA 供标记辅助选择使用。2013年8月9日，将选出的与抗病亲本带型相同的F2单株定植到中国农业大学上庄实验站日光温室，收获F2：3种子。将F2：3种子用4%次氯酸钠消毒5 min，并用去离子水漂洗3～4次，干燥后保存备用。2014年1月23日播种F2：3种子。待幼苗长出2～3片真叶时，取幼嫩叶片提取DNA，供标记选择和验证使用。挑选抗性基因位点纯合的单株于2014年3月5日移栽到中国农业大学科学园温室，进行抗性鉴定。

表1 所用抗病亲本及标记信息

1.2 抗TYLCV 新标记设计

为了获得稳定可靠的分子标记，本试验根据已经克隆的Ty-1和Ty-3基因（Verlann et al.，2013）位点在抗感品种中的序列差异设计引物，获得了功能基因分子标记Ty1-3。该标记是一个InDel 标记，从抗病材料中扩增到的片段大小为209 bp，从感病材料中扩增到的片段大小为197 bp。同时根据Ji 等（2009）报道的Ty-4在染色体上的位置，选择与其最紧密连锁的标记C2_At4g173000，从抗感材料中进行PCR 扩增和序列分析，发现在抗感材料中序列长度不同，据此设计了InDel 标记，命名为CAUTy4。该标记从抗病材料中扩增到的片段大小为219 bp，从感病材料中扩增到的片段大小为214 bp。原来的C2_At4g173000 是一个CAPs 标记（Ji et al.，2009），需要经过PCR、酶切、电泳等过程进行基因型检测，新设计的两个InDel 标记都只需要PCR 和凝胶电泳即可完成基因型检测。

1.3 标记辅助选择策略

采用碱裂解法（Yang ＆ Francis，2005）提取番茄植株基因组DNA。鉴于有些杂交组合涉及到选择3个或3个以上抗性基因，为了减少工作量，本试验首先用一个功能基因标记对相应F2群体的所有植株进行筛选，只有携带纯合抗性基因位点的植株才被用于筛选第2个基因，依此类推。由于有些群体单株数不够多，没有能够获得所有基因位点都纯合的个体，因此保留了部分基因位点杂合的单株供F2：3继续选择。

番茄疮痂病T1 小种抗性位点Rx3的标记检测参考Yang 和Francis（2005）的方法，番茄疮痂病T3 小种抗性位点Rx4的功能基因标记检测参考Pei等（2012）的方法，番茄斑点病抗性基因Pto的功能基因标记检测参考Sun 等（2011）的方法，番茄溃疡病抗性位点Cmm2.0的标记检测参考Coaker 和Francis（2004）的方法，抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3和Ty-4的检测采用如下方法。

PCR反应体系为10 μL，包括2 μL（约10 ng）DNA模板、3.4 μLTaq10 2×Master Mix（北京奥赛博科技发展有限公司生产）、0.3 μL 10 μmol·L-1正向引物、0.3 μL 10 μmol·L-1反 向引物和4 μL ddH2O。PCR 反应条件为：94℃变性5 min，38个循环的94℃变性45 s、55℃退火45 s和72℃延伸45 s，最后一步反应在72℃下保持5 min。PCR 产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色显带后，记录每个单株的基因型。

1.4 抗TYLCV 鉴定

从F2中选出的单株定植到中国农业大学上庄实验站日光温室后自然发病，观察并记载发病情况。F2∶3家系采用人工注射接种在日光温室内进行抗性鉴定，病毒所属株系来自上海的TYLCVSH2，接种后28 d 和42 d 各调查一次。病害分级参考Friedmann 等（1998）的方法进行：0级—接种和没接种的植株一样，没有感病症状，能够正常生长；1级—顶端叶片（叶边缘）出现轻微泛黄；2级—叶片末端有些泛黄和轻微卷曲；3级—大面积叶片变黄，影响更为严重，新叶面积减少，但植株可以继续生长；4级—植物生长发育受到严重影响，叶片基本变黄，甚至变紫，杯状卷曲，停止生长。将0～2级划分为抗病，3～4级划分为感病（Ji et al.，2009）。

由于少数入选的F2：3家系群体较小，因此将来自于同一个F2群体的不同F2：3家系算作一个群体，按100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）进行病情指数计算。

2 结果与分析

2.1 抗TYLCV基因新标记的可靠性分析

为了检验新设计的用于选择抗TYLCV基因标记的可靠性，本试验用Ty1-3 和CAUTy4 这两个标记分析了10 份携带Ty-1、Ty-3、Ty-4中1个或多个基因的番茄材料和1 份新的抗病材料LA 1589 的基因型，以感病品种OH 88119 作为对照。结果显示，两对引物扩增得到的基因型与材料所携带的已知抗性基因完全一致（表2、图1），表明用这两个标记来检测各自的基因型是准确可靠的。同时也发现，新的抗性材料LA 1589 不含有Ty-1、Ty-3和Ty-4基因中的任何一个。

表2 12 份番茄材料经标记Ty1-3 和CAUTy4 检测的基因型及其携带的抗性基因

图1 普通PCR和多重PCR的电泳对比

2.2 标记Ty1-3和CAUTy4的多重PCR体系建立

为了提高检测效率，本试验尝试构建Ty1-3 和CAUTy4 这两个标记的多重PCR 体系，在PCR 体系中同时加入两个标记的引物，对上述12 份材料的基因组DNA 进行PCR 扩增。结果显示（图1），两对引物单独使用时都能从12 份材料中扩增出清晰的条带，同时使用两对引物扩增时，两对引物的PCR 产物条带依然清晰，表明这两个标记可以用多重PCR 进行检测。

2.3 不同抗性基因的聚合选择和抗TYLCV 的鉴定结果

采用功能基因标记Ty1-3 对8个杂交组合（表3）的F1进行PCR 扩增，所有F1植株都带有各自亲本的条带，为杂合型，表明所有单株都是真杂种，为获得用于标记辅助选择的F2群体提供了保障。

根据不同杂交组合所选择基因的需要，确定了每个F2群体的播种种子数，但由于出苗等原因，有些群体没有足够的苗供筛选所有抗性基因位点都纯合的个体，因此在实际筛选时保留少量杂合的基因型，8个组合共获得了57个单株（表3）。

表3 各组合标记选择获得植株数和抗性鉴定结果

将这57个单株于2013年8月9日定植到日光温室里，植株在生长过程中受到了烟粉虱为害，植株自然发生TYLCV 病害。调查显示，所有单株的TYLCV 病级都在0～2 之间，表现出了较好的抗性，并能正常开花坐果，特别是从FG 02-7530×Gc 171组合中选出的4个单株，植株生长健壮，没有任何发病症状（图2-A）。而同时种植在该日光温室里的不带抗性基因的材料则表现出TYLCV 的典型症状，叶片向上卷曲，叶片黄化，植株矮小，生长极其缓慢，不能开花坐果（图2-B）。

图2 FG 02-7530×Gc 171 组合入选植株和不带抗TYLCV基因的植株自然发病情况

对从F2群体中选出的部分一个位点纯合而另外位点杂合的单株F2：3家系进行了标记辅助选择，连同从F2中选出的纯合单株，共得到21个F2：3家系582个单株，包括4个携带5个抗性基因的家系、9个携带3个抗性基因的家系、2个携带2个抗性基因的家系和6个携带1个抗性基因的家系（表3）。

由于接种TYLCV后的两次调查结果基本一致，因此这里只用了接种42 d后的病级及病情指数。接种42 d后，所有单株的病级都在0～2 之间，其中0级的占88.0%，1级的占8.2%，2级的占3.8%。表明采用标记选出的所有单株对所用的病毒株系都具有抗性。

从里格尔87-5×Gc 171 组合中选出两种类型的家系，一种只带Ty-1/Ty-3基因，另一种携带Ty-1/Ty-3和Ty-4基因。前者共有60个单株，其中22个为0级，18个为1级，20个为2级，病情指数为24.2。后者共41个单株，包括16个0级，24个1级和1个2级，病情指数为15.9，而且这两个家系的病情指数都明显高于其他家系（表3）。

3 结论与讨论

用于聚合育种的分子标记必须具有检测的可靠性和操作的简单性，这样才能快速准确地选到目标基因。根据已经克隆的基因在功能区域的序列差异设计标记，是获得较为可靠的功能基因分子标记的途径之一。已有的抗TYLCV基因定位研究表明，抗性基因Ty-1和Ty-3都位于6号染色体上（Zamir et al.，1994；Ji et al.，2007），进一步的研究指出，Ty-1和Ty-3为等位基因（Verlaan et al.，2013）。本试验依据已经克隆的TYLCV基因Ty-1和Ty-3与感病材料中对应基因的序列差异设计引物，建立了功能基因分子标记Ty1-3。用该标记对Zamir 等 （1994）报道的携带Ty-1基因的材料LA 3473 进行基因型分析，结果显示其条带与携带Ty-3材料的条带一致，也验证了Ty-1和Ty-3是等位基因。由这个标记选择的单株都具有很好的抗病性，表明该标记的确为功能基因分子标记，可用于对这两个基因的选择。而Ji 等（2009）报道的与Ty-4基因紧密连锁的标记是CAPs 标记，需要经过PCR、酶切等相对复杂的过程，本试验中根据该标记在抗感材料中的序列差异设计成InDel 标记，只需要PCR 即可，简化了检测过程。用两个新设计的标记筛选相应的基因，所得到的植株都表现出很好的抗性，表明这两个新标记是可靠的。

利用不同的材料将不同的抗性基因聚合到同一个材料中，能够增加番茄材料抗病毒生理小种的范围，大大提高植株对病害的抗性，使其抗性更加稳定 持 久（Banerjee & Kallo，1987；Vidavski et al.，2008）。Mejía 等（2005）利用不同的番茄材料在危地马拉进行抗病性评估，含有纯合Ty-2基因型的材料在当地表现为感病，含有Ty-2和Ty-3a杂合基因型的材料表现抗病。另外，含有杂合基因型Ty-2和Ty-3a的材料比只含Ty-3纯合基因型的材料表现出更高的抗性水平。在本试验中，无论是只含有Ty-1，或者Ty-1和Ty-3，还是同时含有Ty-1、Ty-3和Ty-4的材料，对所用的病毒菌株都具有较好的抗性。但在不同的遗传背景下抗性略有差异，当以FG 02-7530、IBL 2353、IBL 2361、OH9242、ZN 17、WGH12-3032 等为受体材料时，所得到的植株都表现出很强的抗性，而以里格尔87-5 为受体时，后代中无论是携带Ty-1/Ty-3基因还是同时携带Ty-1/Ty-3和Ty-4基因的植株，其抗性都比其他材料的略差，不过同时携带Ty-1/Ty-3和Ty-4基因的植株抗性要好于只携带Ty-1/Ty-3基因的植株。这些结果表明，遗传背景对抗性基因的表达可能有一定的影响。

群体大小是影响多基因聚合育种效率的因素之一，聚合效率随着群体中个体数的增加而加大，如果基础群体太小，就有可能得不到所需要的纯合基因型个体。本试验根据每个F2群体所聚合的基因数目确定的播种量播种，但由于种子发芽率偏低（种子收获于2012年12月），因此8个F2群体中有6个没有达到预期的供选植株数，导致从群体中选择所有基因位点都纯合的单株数偏少，在5个聚合2～5个基因的F2群体中只有2.7%的单株在所有基因位点都表现为纯合型。为了获得更多在所有位点都纯合的单株，在实际选择时保留了一些杂合基因型个体供F2：3进一步选择，这样做虽然最终获得了所有位点都纯合的基因型个体，但增加了世代数和选择成本，降低了聚合效率。因此，在进行聚合育种时，可先检测种子的发芽率，然后结合聚合的基因数确定播种量，以便充分发挥分子标记聚合育种的优势。

本试验所用的番茄材料涉及到斑点病、疮痂病、溃疡病和TYLCV，但仅对所选到的植株进行了抗TYLCV 的鉴定。原因在于选择番茄斑点病抗性基因Pto和疮痂病抗性基因Rx4用的是功能基因分子标记，这两个基因的功能分子标记已经被证实可直接用于抗性基因的选择（Yang & Francis，2005；Pei et al.，2012）。疮 痂 病 抗 性位点Rx3和溃疡病抗性位点Cmm2.0是两个尚未被克隆的QTL，但是已有的研究表明，利用与Rx3位点紧密连锁的标记可准确选择到携带该位点的抗性单株（Yang & Francis，2005；张晓敏 等，2009），而利用与Cmm2.0紧密连锁的标记也可准确获得抗溃疡病的单株（Coaker & Francis，2004）。鉴于本试验所用的抗性材料和分子标记与文献中（Coaker & Francis，2004；Yang & Francis，2005；张晓敏 等，2009；Pei et al.，2012）的相同，因此推测本试验所选的携带抗性基因的材料即为抗病材料。

综上所述，本试验开发了抗TYLCV基因Ty-1/Ty-3和Ty-4的新标记，并建立了多重PCR 体系。通过杂交结合标记辅助选择，将抗TYLCV、斑点病、疮痂病、溃疡病等的基因分别聚合，获得了7份兼抗斑点病、TYLCV 和疮痂病的材料，6 份携带多个TYLCV基因（Ty-1/Ty-3和Ty-4）的材料，以及1 份兼抗TYLCV 和溃疡病的材料，为番茄抗多个病害分子标记聚合育种提供了材料。

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