水蛭素活性因子抗癌作用的实验研究

崔美月++++++王兴福++++++闫怀玲

[摘要] 目的 观察水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞、S180肉瘤的抑制作用，为临床用药提供理论依据。 方法 取小鼠48只，每只小鼠左前腋下接种H22肝癌瘤细胞0.2 mL，随机分为4组，每组12只，分成模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大剂量组（水蛭素活性因子2.6 g/kg）和水蛭素活性因子小剂量组（水蛭素活性因子1.3 g/kg）；另取小鼠44只，每只小鼠左前腋下接种S180肉瘤细胞0.2 mL，随机分为4组，每组11只，分成模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大剂量组（水蛭素活性因子2.6 g/kg）和水蛭素活性因子小剂量组（水蛭素活性因子1.3 g/kg）；连续给药14 d，比较各组肿瘤生长情况，并计算抑瘤率。 结果 ①水蛭素活性因子对H22肝癌实体瘤的影响：5-FU组[瘤重（0.78±0.41）g]、水蛭素活性因子大剂量组[瘤重（0.99±0.48）g]、水蛭素活性因子小剂量组[瘤重（1.15±0.50）g]对H22肝癌抑瘤率分别为58.73%、47.62%、39.15%，与模型对照组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），其中水蛭素活性因子大、小剂量组比较，大剂量组抑瘤作用明显优于小剂量组（P < 0.05），呈现一定的量效关系。②水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响：5-FU组[瘤重（0.68±0.30）g]、水蛭素活性因子大剂量组[瘤重（0.85±0.44）g]、水蛭素活性因子小剂量组[瘤重（0.89±0.47）g]对S180肉瘤抑瘤率分别为54.67%、43.33%、40.67%，与模型对照组相比，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），其中水蛭素活性因子大、小剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。③所有5-FU组小鼠在给药第9天开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等，而水蛭素活性因子组小鼠未发生此现象。 结论 水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞和S180肉瘤均有较好的抑制作用，且水蛭素因子无明显副作用。

[关键词] 水蛭素活性因子；H22肝癌瘤细胞；S180肉瘤；副作用

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（b）-0008-03

Experimental study of anti-tumor effect of hirudin active factor

CUI Meiyue WANG Xingfu YAN Huailing

Department of Internal Medicine， the Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Ji'nan 250001， China

[Abstract] Objective To observe the anti-tumor effect of hirudin active factor on H22 liver tumor cells and S180 sarcoma， thus to provide theoretical basis for clinical pharmacy. Methods 48 mice were selected， 0.2 mL H22 liver tumor cells inoculated subcutaneously， divided into 4 groups， each group had 12 mice. Four groups were named as control group， 5-FU group， high-dose hirudin group （hirudin active factor 2.6 g/kg）， low-dose hirudin group （hirudin active factor 1.3 g/kg）. Another 44 mice were selected， 0.2 mL S180 sarcoma cell inoculated subcutaneously， divided into 4 groups， each group had 11 mice. Four groups were named as control group， 5-FU group， high-dose hirudin group （hirudin active factor 2.6 g/kg）， low-dose hirudin group （hirudin active factor 1.3 g/kg）. All mice were treated by saline， 5-FU group， high-dose hirudin， low-dose hirudin respectively for 14 days daily. The growth of carcinoma cell were compared， and the anti-carcinoma rate was calculated. Results ①The effect of hirudin active factor on H22 solid liver cancer： the anti-carcinoma rates of 5-FU group [tumor weight （0.78±0.41） g]， high-dose hirudin group [tumor weight （0.99±0.48） g]， low-dose hirudin group [tumor weight （1.15±0.50） g] to H22 solid liver cancer were 58.73%， 47.62% and 39.15% respectively， had obvious difference compared to control group （P < 0.01 or P < 0.05）； and the anti-carcinoma rate of high-dose hirudin group was obviously higher than the low-dose hirudin group （P < 0.05）， which showed dose-effect relationship. ②The effect of hirudin active factor on S180 sarcoma cell： the anti-carcinoma rates of 5-FU group [tumor weight （0.68±0.30） g]， high-dose hirudin group [tumor weight （0.85±0.44）g]， low-dose hirudin group [tumor weight （0.89±0.47） g] to S180 sarcoma cell were 54.67%， 43.33% and 40.67% respectively， had obvious difference compared to control group （P < 0.01 or P < 0.05）； and the difference of anti-carcinoma rate was not obvious between high-dose hirudin group and low-dose hirudin group （P > 0.05）. ③All the mice of 5-FU group got malaise， curled up， hair slip and eat less on day 9， the mice of hirudin active factor group were escapable of those phenomena. Conclusion Hirudin active factor can restrain the growth of H22 liver tumor cells and S180 sarcoma obviously， and which has no side effect.

[Key words] Hirudin active factor； H22 liver tumor cells； S180 sarcoma； Side effect

中药水蛭始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀功能，临床用于治疗癓瘕积聚、血瘀闭经、跌打损伤、血小板增多症等[1]。现代医学研究证实，水蛭的活性成分是水蛭素，水蛭素是从医用水蛭的唾液腺中提取分离得到的一种多肽，是迄今发现的活性最强的凝血酶抑制剂[2]，具有抗凝、抗血栓等作用，临床广泛用于治疗心血管病[3-4]、脑血管病[5-6]、肾脏疾病[7]等均取得满意疗效。近年来，随着对水蛭素研究的不断深入，其抗肿瘤作用成为一个研究热点。为了进一步探讨水蛭素的抗肿瘤疗效，本研究采用肝癌实体瘤和S180肉瘤小鼠模型观察水蛭素的抑瘤效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

昆明种健康、雄性小白鼠，体重（22.0±0.5）g，由山东省实验动物中心提供，医学实验动物合格证号：动管质字（2008）第0179号。

1.1.2 细胞株

H22肝癌瘤细胞、S180肉瘤细胞瘤株，由山东省医学科学院药物研究所细胞室提供。

1.1.3 药品

5-氟尿嘧啶（5-FU），50 mg/片，由上海第一药厂生产，批号：070816。水蛭素活性因子，由山东省医科院基础医学研究所提供。

1.1.4 仪器

超净工作台，江苏南京科技器材开发公司生产；HK-Ⅱ型扭力天平，江苏无锡净化设备厂生产。

1.2 方法

1.2.1 水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞的影响

1.2.1.1 肿瘤接种造模 选择腹腔接种H22肝癌实体瘤株后6～9 d、生长良好的H22肝癌小鼠，放置于超净工作台，腹部皮肤消毒后打开小鼠腹腔，抽取乳白色瘤液，用生理盐水配制成含瘤细胞2×106/mL的细胞悬液。选取48只小鼠，每只小鼠左前腋下皮肤消毒后，接种H22肝癌瘤细胞悬液0.2 mL，次日开始给药。

1.2.1.2 动物分组与用药 将接种瘤细胞后的48只小鼠，随机法分成4组，每组12只：模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组。模型对照组给予同体积的生理盐水；5-FU组给予5-FU 0.15 g/kg；水蛭素大、小剂量组分别给予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。48只小鼠每日灌胃1次，每次0.5 mL，连续给药14 d，于第15天脱颈椎处死小鼠，剥离瘤块，将瘤块置扭力天平上称瘤重，计算抑瘤率：（C-T）/C×100%（C为模型对照组平均瘤重，T为给药组平均瘤重）；比较各组肿瘤生长情况；在实验过程中严密观察小鼠的精神状态、活动、毛发、饮食等。

1.2.2 水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响

1.2.2.1 肿瘤接种造模 选择腹腔接种S180肉瘤瘤株后6～9 d、生长良好的S180肉瘤小鼠，放置于超净工作台，腹部皮肤消毒后打开小鼠腹腔，抽取乳白色瘤液，用生理盐水配制成含瘤细胞2×106/mL的细胞悬液。选取44只小鼠，每只小鼠左前腋下皮肤消毒后，接种S180肉瘤细胞悬液0.2 mL，次日开始给药。

1.2.2.2 动物分组与用药 将接种瘤细胞后的44只小鼠，随机法分成4组，每组11只：模型对照组、5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组。模型对照组给予同体积的生理盐水；5-FU组给予5-FU 0.15 g/kg；水蛭素大、小剂量组分别给予水蛭素活性因子2.60、1.30 g/kg。44只小鼠每日灌胃1次，每次0.5 mL，连续给药14 d，于第15天脱颈椎处死小鼠，剥离瘤块，将瘤块置扭力天平上称瘤重，计算抑瘤率：（C-T）/C×100%（C为模型对照组平均瘤重，T为给药组平均瘤重）；比较各组肿瘤生长情况；在实验过程中严密观察小鼠的精神状态、活动、毛发、饮食等。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞的影响

各用药组瘤重与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组对H22肝癌抑瘤率分别为58.73%、47.62%、39.15%（P < 0.01或P < 0.05），其中，水蛭素活性因子大剂量组明显优于小剂量组，呈现一定的量效关系。见表1。

表1 水蛭素活性因子对H22肝癌瘤细胞的影响（x±s）

注：与模型对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与水蛭素活性因子小剂量组比较，#P < 0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶； “-”表示无数据

2.2 水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响

各用药组瘤重与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。5-FU组、水蛭素活性因子大、小剂量组对S180肉瘤抑瘤率分别为54.67%、43.33%、40.67%（P < 0.01或P < 0.05），其中，大、小剂量水蛭素活性因子组相比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2 水蛭素活性因子对S180肉瘤的影响（x±s）

注：与模型对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与水蛭素活性因子小剂量组比较，#P < 0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶；“-”表示无数据

2.3 肿瘤外观及小鼠表现

接种H22肝癌瘤细胞和接种S180肉瘤细胞的小鼠，给予水蛭素活性因子治疗后，其瘤块颜色苍白，与周围组织粘连较少，剥离较易，出血少；模型对照组的小鼠瘤块颜色紫暗，与周围组织粘连较多，剥离困难，出血较多。5-FU组的抑瘤率虽然高于水蛭素活性因子大、小剂量组，但在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等，而水蛭素活性因子大、小剂量组小鼠未发生此现象。

3 讨论

近年来，随着对中药水蛭素研究的深入，水蛭素被发现可治疗多系统的肿瘤。黄光武等[8]通过实验发现，水蛭对体外血小板聚集的抑制效果良好，对血小板聚集功能亢进的头颈部恶性肿瘤的转移可能有抑制作用。成军等[9]研究发现，水蛭素可通过降低TRmRNA在胰腺癌细胞中的表达量而降低实验性肿瘤的转移。王杰等[10]用复方水蛭素治疗小鼠异体移植的W256肿瘤、胃癌靶细胞（NKM），结果显示复方水蛭素对W256肿瘤和胃癌靶细胞都有明显的抑制作用。贺彬等[11]研究显示，水蛭素对人舌鳞癌细胞株TCA8113细胞生长呈抑制作用。谭祥华等[12]研究显示，活血化瘀法对肿瘤作用机制为全方位、多靶点作用，活血化瘀类中药可通过改善血液流变学，降低血液黏度，调节癌基因及其信号传递，抑制血管生成以及诱导肿瘤细胞发生凋亡等方式来抑制肿瘤细胞生长，阻断肿瘤发生转移。水蛭素是从活血化瘀代表药水蛭中提取的有效物质，它对上述多系统肿瘤的作用，也证实了其全方位、多靶点作用。目前，临床上西医治疗肿瘤副作用大，给肿瘤的治疗带来了局限性，而中药由于疗效好、副作用少而在临床肿瘤治疗方面占有一定优势。本研究结果也显示，水蛭素活性因子能显著抑制小鼠H22肝癌实体瘤和S180肉瘤，且未发现明显的副作用；而5-FU组在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等副作用。因此，水蛭素作为新的抗肿瘤药物，因其抗肿瘤作用强、副作用少而在临床治疗肿瘤方面将发挥更大的作用。

[参考文献]

[1] 凌一揆.中药学[M].上海：上海科学技术出版社，1984：162.

[2] Markwardt F. Hirudin as altermative anticoagulant-a historical review [J]. Semin Thromb Henost，2002，28（5）：405-414.

[3] 王海峰.水蛭素治疗急性冠状动脉综合征的疗效观察[J].中国医学指南，2013，11（4）：292-293.

[4] 唐瑜菁，张莲芬，段作营，等.水蛭素促尿激酶纤溶作用研究[J].中国药理学通报，2006，22（1）：89.

[5] 刘坤，姚阳.水蛭素对大鼠脑出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白claudin-5表达的作用[J].沈阳医学院学报，2011，13（3）：137-139.

[6] 刘国庆，袁建喜.水蛭素治疗脑出血疗效观察[J].中外医学研究，2013，11（2）：138-139.

[7] 李莹，崔丽.水蛭素药物治疗尿微量白蛋白为主要表现的糖尿病肾病和高血压肾病的临床研究[J].临床合理用药，2010，3（22）：6-7.

[8] 黄光武，邝国乾，农辉图，等.水蛭对人血小板聚集抑制的探讨[J].广西医科大学学报，1997，14（4）：21.

[9] 成军，朱国静，丁义涛，等.组织因子，凝血酶受体与血栓调节蛋白在胰腺癌细胞中的表达[J].中华实验外科杂志，2000，17（2）：109-111.

[10] 王杰，韩俊庆，李伯辉，等.复方水蛭素的药效学研究[J].山东大学学报：医学版，2007，45（8）：852-854.

[11] 贺彬，苏承武，蔡捷，等.水蛭素联合阿霉素对TCA 8113细胞株作用机制的研究[J].现代中西医结合杂志，2011， 20（12）：1447-1450.

[12] 谭祥华，陈华琼，植品隆.试述活血化瘀药物抗肿瘤复发转移[J].医学信息，2012，25（3）：626-627.

（收稿日期：2013-10-23 本文编辑：程 铭）

3 讨论

近年来，随着对中药水蛭素研究的深入，水蛭素被发现可治疗多系统的肿瘤。黄光武等[8]通过实验发现，水蛭对体外血小板聚集的抑制效果良好，对血小板聚集功能亢进的头颈部恶性肿瘤的转移可能有抑制作用。成军等[9]研究发现，水蛭素可通过降低TRmRNA在胰腺癌细胞中的表达量而降低实验性肿瘤的转移。王杰等[10]用复方水蛭素治疗小鼠异体移植的W256肿瘤、胃癌靶细胞（NKM），结果显示复方水蛭素对W256肿瘤和胃癌靶细胞都有明显的抑制作用。贺彬等[11]研究显示，水蛭素对人舌鳞癌细胞株TCA8113细胞生长呈抑制作用。谭祥华等[12]研究显示，活血化瘀法对肿瘤作用机制为全方位、多靶点作用，活血化瘀类中药可通过改善血液流变学，降低血液黏度，调节癌基因及其信号传递，抑制血管生成以及诱导肿瘤细胞发生凋亡等方式来抑制肿瘤细胞生长，阻断肿瘤发生转移。水蛭素是从活血化瘀代表药水蛭中提取的有效物质，它对上述多系统肿瘤的作用，也证实了其全方位、多靶点作用。目前，临床上西医治疗肿瘤副作用大，给肿瘤的治疗带来了局限性，而中药由于疗效好、副作用少而在临床肿瘤治疗方面占有一定优势。本研究结果也显示，水蛭素活性因子能显著抑制小鼠H22肝癌实体瘤和S180肉瘤，且未发现明显的副作用；而5-FU组在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等副作用。因此，水蛭素作为新的抗肿瘤药物，因其抗肿瘤作用强、副作用少而在临床治疗肿瘤方面将发挥更大的作用。

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[3] 王海峰.水蛭素治疗急性冠状动脉综合征的疗效观察[J].中国医学指南，2013，11（4）：292-293.

[4] 唐瑜菁，张莲芬，段作营，等.水蛭素促尿激酶纤溶作用研究[J].中国药理学通报，2006，22（1）：89.

[5] 刘坤，姚阳.水蛭素对大鼠脑出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白claudin-5表达的作用[J].沈阳医学院学报，2011，13（3）：137-139.

[6] 刘国庆，袁建喜.水蛭素治疗脑出血疗效观察[J].中外医学研究，2013，11（2）：138-139.

[7] 李莹，崔丽.水蛭素药物治疗尿微量白蛋白为主要表现的糖尿病肾病和高血压肾病的临床研究[J].临床合理用药，2010，3（22）：6-7.

[8] 黄光武，邝国乾，农辉图，等.水蛭对人血小板聚集抑制的探讨[J].广西医科大学学报，1997，14（4）：21.

[9] 成军，朱国静，丁义涛，等.组织因子，凝血酶受体与血栓调节蛋白在胰腺癌细胞中的表达[J].中华实验外科杂志，2000，17（2）：109-111.

[10] 王杰，韩俊庆，李伯辉，等.复方水蛭素的药效学研究[J].山东大学学报：医学版，2007，45（8）：852-854.

[11] 贺彬，苏承武，蔡捷，等.水蛭素联合阿霉素对TCA 8113细胞株作用机制的研究[J].现代中西医结合杂志，2011， 20（12）：1447-1450.

[12] 谭祥华，陈华琼，植品隆.试述活血化瘀药物抗肿瘤复发转移[J].医学信息，2012，25（3）：626-627.

（收稿日期：2013-10-23 本文编辑：程 铭）

3 讨论

近年来，随着对中药水蛭素研究的深入，水蛭素被发现可治疗多系统的肿瘤。黄光武等[8]通过实验发现，水蛭对体外血小板聚集的抑制效果良好，对血小板聚集功能亢进的头颈部恶性肿瘤的转移可能有抑制作用。成军等[9]研究发现，水蛭素可通过降低TRmRNA在胰腺癌细胞中的表达量而降低实验性肿瘤的转移。王杰等[10]用复方水蛭素治疗小鼠异体移植的W256肿瘤、胃癌靶细胞（NKM），结果显示复方水蛭素对W256肿瘤和胃癌靶细胞都有明显的抑制作用。贺彬等[11]研究显示，水蛭素对人舌鳞癌细胞株TCA8113细胞生长呈抑制作用。谭祥华等[12]研究显示，活血化瘀法对肿瘤作用机制为全方位、多靶点作用，活血化瘀类中药可通过改善血液流变学，降低血液黏度，调节癌基因及其信号传递，抑制血管生成以及诱导肿瘤细胞发生凋亡等方式来抑制肿瘤细胞生长，阻断肿瘤发生转移。水蛭素是从活血化瘀代表药水蛭中提取的有效物质，它对上述多系统肿瘤的作用，也证实了其全方位、多靶点作用。目前，临床上西医治疗肿瘤副作用大，给肿瘤的治疗带来了局限性，而中药由于疗效好、副作用少而在临床肿瘤治疗方面占有一定优势。本研究结果也显示，水蛭素活性因子能显著抑制小鼠H22肝癌实体瘤和S180肉瘤，且未发现明显的副作用；而5-FU组在给药的第9天小鼠开始出现精神萎靡、蜷缩少动、脱毛、食欲减退等副作用。因此，水蛭素作为新的抗肿瘤药物，因其抗肿瘤作用强、副作用少而在临床治疗肿瘤方面将发挥更大的作用。

[参考文献]

[1] 凌一揆.中药学[M].上海：上海科学技术出版社，1984：162.

[2] Markwardt F. Hirudin as altermative anticoagulant-a historical review [J]. Semin Thromb Henost，2002，28（5）：405-414.

[3] 王海峰.水蛭素治疗急性冠状动脉综合征的疗效观察[J].中国医学指南，2013，11（4）：292-293.

[4] 唐瑜菁，张莲芬，段作营，等.水蛭素促尿激酶纤溶作用研究[J].中国药理学通报，2006，22（1）：89.

[5] 刘坤，姚阳.水蛭素对大鼠脑出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白claudin-5表达的作用[J].沈阳医学院学报，2011，13（3）：137-139.

[6] 刘国庆，袁建喜.水蛭素治疗脑出血疗效观察[J].中外医学研究，2013，11（2）：138-139.

[7] 李莹，崔丽.水蛭素药物治疗尿微量白蛋白为主要表现的糖尿病肾病和高血压肾病的临床研究[J].临床合理用药，2010，3（22）：6-7.

[8] 黄光武，邝国乾，农辉图，等.水蛭对人血小板聚集抑制的探讨[J].广西医科大学学报，1997，14（4）：21.

[9] 成军，朱国静，丁义涛，等.组织因子，凝血酶受体与血栓调节蛋白在胰腺癌细胞中的表达[J].中华实验外科杂志，2000，17（2）：109-111.

[10] 王杰，韩俊庆，李伯辉，等.复方水蛭素的药效学研究[J].山东大学学报：医学版，2007，45（8）：852-854.

[11] 贺彬，苏承武，蔡捷，等.水蛭素联合阿霉素对TCA 8113细胞株作用机制的研究[J].现代中西医结合杂志，2011， 20（12）：1447-1450.

[12] 谭祥华，陈华琼，植品隆.试述活血化瘀药物抗肿瘤复发转移[J].医学信息，2012，25（3）：626-627.

（收稿日期：2013-10-23 本文编辑：程 铭）