天山雪菊不同溶剂提取物的抗氧化活性研究

刘博奥，刘继国，刘伟，潘晓博，祁英，刘玉梅*

（新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046）

天山雪菊不同溶剂提取物的抗氧化活性研究

刘博奥，刘继国，刘伟，潘晓博，祁英，刘玉梅*

（新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046）

以天山雪菊为原料，经过超临界二氧化碳萃取后，萃余物又分别采用丙酮、体积分数分别为50%、95%乙醇进行提取，获得不同溶剂提取的4种天山雪菊提取物，比较不同溶剂提取物的抗氧化活性。通过对二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基和羟基自由基清除能力的评价，比较各种提取物的抗氧化活性，并对各种提取物中的总多酚和总黄酮的含量进行了分析。结果表明，4种提取物对DPPH自由基均具有较强清除活性，但活性弱于对照品二丁基羟基甲苯（BHT）、水溶性维生素E（Trolox）、α-生育酚和Vc；对羟基自由基的清除能力低于对照品芦丁和BHT。清除DPPH自由基的能力以体积分数为50%乙醇提取物最强，超临界浸膏最弱；清除羟基自由基的活性以体积分数为50%乙醇提取物最强，丙酮提取物最弱。

天山雪菊；抗氧化；黄酮；多酚；羟基自由基；DPPH自由基

天山雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）又称两色金鸡菊，一年生草本植物，高30～60cm[1]。近年来的研究发现，天山雪菊中含有的大量黄酮类化合物，具有较高的生物活性，可应用于功能性食品[2]。现代科学技术研究表明，生命体中细胞的退化、衰老和癌变等现象的发生可能与自由基有关，自由基的形成与发展多与氧细胞的正常代谢有关，细胞在氧化过程中产生例如单线态氧自由基、羟基自由基和过氧自由基等自由基一旦泄露到细胞外，即可能与生物体内蛋白质、核酸分子相互作用从而对其产生毒害[3]。20世纪80年代以来，对黄酮类化合物的研究逐渐转向关注其清除自由基和抗氧化能力等[4]。雪菊富含黄酮和多酚类化合物，研究其各种提取物的抗氧化和清除自由基的能力可为雪菊的开发利用提供参考。

本研究首先采用超临界二氧化碳萃取技术获得了天山雪菊的脂溶性提取物。由于超临界二氧化碳萃取具有操作条件温和、活性成分不易被破坏、无有机溶剂残留的优点[5-7]，其萃余物又分别采用丙酮及体积分数分别为50%、95%的乙醇等不同溶剂进行提取，获得雪菊不同溶剂的提取物，在分析了各种提取物中的总多酚和总黄酮的前提下，对天山雪菊的各种提取物清除羟基自由基和DPPH自由基的清除能力进行了研究，旨在为天山雪菊的进一步开发利用提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天山雪菊：市售，产地新疆和田地区，低温干燥保存，使用前粉碎。CO2：新疆山下科技有限公司提供；二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazy1，DPPH）、福林-酚试剂、α-生育酚、水溶性维生素E（Trolox）、维生素C：美国Sigma-Aldrich公司；芦丁：中国药品生物制品检定所；二丁基羟基甲苯（butylatecl hyclroxy toluene，BHT）、邻二氮菲、硫酸亚铁、双氧水、磷酸盐等其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

SFE230-50-06型超临界流体萃取装置：江苏海安华达石油仪器有限公司；UV5300PC型紫外-可见光光度计：上海元析分析仪器厂；668型真空干燥箱：大连第四仪表厂；DHP-420型电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；BS210S型电子天平：德国赛多利斯集团。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

超临界二氧化碳萃取浸膏制备：在萃取温度60℃、萃取压力25MPa、CO2流速为35L/h的条件下采用超临界CO2萃取装置提取天山雪菊脂溶性提取物（提取率为10.67%），得到超临界CO2萃取浸膏样品，萃余物留作溶剂提取。测定时称取一定质量的浸膏溶解在甲醇溶剂中配制到实验所需的浓度。

溶剂提取物制备：超临界二氧化碳萃取的萃余物，精确称取1.0000g，置于50mL锥形瓶中，分别用丙酮及体积分数为50%、95%的乙醇等溶剂各15mL萃取，每次萃取30min（期间超声波辅助提取15min）；真空抽滤，滤渣重复提取2次。过滤后合并滤液，转移至250mL容量瓶中用相应的萃取溶剂定容，混合均匀，测定时根据需要进行相应的稀释处理。

1.3.2 总黄酮含量的测定

采用AlCl3比色法测定[8]，以105℃预先烘至质量恒定的芦丁为标准定量。准确称取109.1mg芦丁标准品于100mL的容量瓶中，加入体积分数为60%乙醇超声溶解后，用体积分数为60%乙醇定容至刻度，摇匀，此为标准储备液。准确移取此标准储备液10mL于50mL容量瓶中，加入体积分数为30%乙醇溶液稀释至刻度，混合均匀（含无水芦丁0.218mg/mL），此为标准母液。准确移取上述标准母液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL分别置于25mL容量瓶中，分别补加体积分数为30%乙醇至溶液体积为10mL，精确加入1mL 5%的NaNO2溶液，避光保存1h，加入1mL10%的Al（NO3）2，混匀，放置6min；再加入10mL1mol/L的NaOH溶液，用蒸馏水定容；摇匀后静置反应15min。以不加标准样品的溶液同上述步骤制备参比，在λ=510nm处测定吸光度值。根据A510nm吸光值对应芦丁质量浓度进行线性回归，制作标准曲线。将上述步骤中加入的1.0mL标准溶液改为1.0mL样品溶液，其余测定步骤同标准，获得样品溶液的吸光值，根据标准曲线计算样品中总黄酮的浓度。

1.3.3 总多酚含量的测定

采用福林-酚比色法（Folin-Ciocalteu）测定[9]，以真空干燥至质量恒定的没食子酸为标准。准确称取44.3mg的没食子酸标准品于100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容后摇匀，此为标准原液。以此溶液配制成质量浓度分别为8.86mg/L、17.72mg/L、35.44mg/L、70.88mg/L、88.60mg/L、106.32mg/L的系列标准溶液。分别移取1mL上述标准溶液于10mL容量瓶中，依次加入1mL去离子水，0.5mL已用去离子水稀释2倍的福林-酚试剂，摇匀静置5min后移入1.5mL 20%的Na2CO3溶液，用去离子水定容至刻度，混合均匀后在室温条件下避光反应2h。在λ=760nm处测其吸光度值，以A760nm吸光值对应没食子酸质量浓度进行线性回归，得到总多酚测定的标准曲线。将上述测定步骤中加入的1mL标准溶液改为加入1mL样品溶液，即可得到样品溶液的吸光值，根据标准曲线可计算样品中的总多酚浓度。

1.3.4 羟基自由基的清除能力测定

采用邻二氮菲-二价铁氧化法[10]。Fenton反应可以使H2O2-Fe2+体系产生羟基自由基，H2O2-Fe2+水溶液可以被羟基自由基氧化为邻二氮菲-三价铁，反应后其在536nm处最大吸收峰消失，据此可推算体系中羟基自由基的变化。实验步骤如下：称取1.486 7g邻二氮菲，用100mL无水乙醇配制成0.075mol/L邻二氮菲醇溶液，使用前用重蒸水稀释100倍。取1mL样品于20mL试管中，依次加入1mL 0.75mmol/L邻二氮菲，pH=7.4的0.2mmol/L磷酸盐缓冲溶液2mL，浓度为0.75mmol/L FeSO4溶液1mL。充分摇匀，置于37℃保温箱中保温1h。取出后冷却，以重蒸水作空白，测其536nm波长下吸光度值A（样）。损伤管加入1mL 0.1%的H2O2用来代替样品管中的1mL样品A（损）；未损伤管用2mL重蒸水分别代替样品管中1mL样品的和1mL的H2O2，记为A（未）。

式中：A（样）表示样品管的吸光度值；A（损）表示损伤管的吸光度值；A（未）表示未损伤管的吸光度值。

1.3.5 DPPH自由基的清除能力测定

二苯基苦基苯肼（DPPH）是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm处有强吸收，若加入抗氧化物质，其单电子被配对[11-12]，紫外可见光区517nm处最大吸收峰消失，据此可测定对DPPH的清除效果。用甲醇配制成0.04mg/mL的DPPH标准溶液。取1mL质量浓度在0.02～4.00mg/mL的样品于试管中，加入DPPH溶液3mL，充分混匀，放置1h。用1mL甲醇作为空白对照组代替样品，在517nm处测其吸光度值。

式中：A（样）表示添加样品时溶液吸光度值；A（控）表示未添加样品时溶液的吸光值。

1.3.6 统计分析

实验数据的处理及统计分析均是采用Microsoft Excel或OriginPro8.0专业软件来处理的，数据表示为平均值（n≥3）±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程的建立

采用芦丁比色法，以芦丁质量浓度C-吸光度值A510nm作图，得到芦丁标准曲线见图1（A），标准曲线线性回归方程为C=2.097 3A510nm-0.001 4，相关系数R2=0.999 8，线性范围0.255～2.041mg/mL。采用福林酚比色法，以没食子酸质量浓度-吸光度值A760nm作图，得到没食子酸标准曲线见图1（B），标准曲线线性回归方程为C=82.8500A760nm-3.4615，相关系数R2=0.997 8，线性范围8.8～106.3mg/L。

图1 芦丁(A)和没食子酸(B)的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin(A)and gallic acid(B)

2.2 雪菊不同溶剂提取物中的总多酚和总黄酮的含量

多酚和黄酮类物质在自然界分布广泛，且大多具有非常强的抗氧化活性，是人们自饮食摄入最多的抗氧化物质[13]。大量研究也表明，总多酚和总黄酮的含量高低与抗氧化活性的强弱有明显的相关性[14]。菊科植物多含有多种多酚和黄酮类化合物[15]，由于不同种类的多酚和黄酮类物质的溶解性质不同，采用不同的溶剂提取得到的提取物中所含多酚和黄酮的种类和数量也会有差异。因此，为了综合评价雪菊不同溶剂提取物的抗氧化活性，试验中首先对各种雪菊提取物中总多酚和总黄酮类化合物含量进行了分析检测，结果见表1。

表1 雪菊不同提取物的总多酚和总黄酮含量的分析Table 1 Contents of total polyphenol and total flavonoids from different extractions ofC.tinctoria

由表1可知，丙酮萃取物中黄酮类和多酚类化合物含量最低，体积分数为95%乙醇萃取物中黄酮类和多酚类化合物含量次之，体积分数为50%乙醇萃取物中黄酮和多酚化合物的含量最高；体积分数为50%乙醇提取的雪菊提取物中的总多酚和总黄酮的含量分别为丙酮提取物的5.4倍和4.9倍，约为体积分数为95%的乙醇提取物的2倍左右。

2.3 雪菊不同溶剂提取物清除DPPH自由基能力的评价

DPPH在有机溶剂中以一种稳定的以氮为中心的自由基而存在，当体系中加入受测物有一定的自由基清除能力时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，其清除率活性的高低可通过测定吸收减弱的程度来评价。清除活性通常以清除体系中50%DPPH自由基的半数清除率（concentrationfor 50%ofmaximaleffect，EC50）值作为衡量手段，该值越小样品清除DPPH自由基的能力越强。图2为不同溶剂的雪菊提取物在不同的质量浓度下对DPPH自由基的清除率的剂量曲线，曲线斜率越大，则对DPPH自由基的清除能力越强。合成抗氧化剂BHT、VC、Trolox及天然来源的α-生育酚作为对照，因VC、Trolox及α-生育酚的曲线与BHT近似，为避免曲线重叠，图2中仅列出BHT曲线作为对照。

图2 雪菊不同溶剂提取物清除DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of different extractions of C.tinctoria

由图2可知，雪菊的4种提取物均具有清除DPPH自由基的作用，且随着提取物质量浓度的增加，清除能力均逐渐增加，但与对照品BHT相比，体积分数为50%的乙醇提取物和体积分数为95%乙醇提取物略低，而丙酮提取物与超临界浸膏的清除活性远小于上述对照品，样品清除DPPH自由基的半数清除率见表2。

表2 雪菊不同溶剂提取物清除DPPH自由基的半数清除率（EC50值）Table 2 Hydroxyl radical scavenging activity（EC50）of different extractions ofC.tinctoria

由表2可知，样品清除DPPH自由基能力大小依次为：体积分数为50%乙醇提取物>体积分数为95%乙醇提取物>丙酮提取物>超临界CO2浸膏，但样品的半数清除率均小于对照品，特别是超临界CO2浸膏，清除率仅为各对照品的1%～2%。

2.4 雪菊提取物清除羟基自由基能力的评价

在体外实验体系中，通过评价羟基自由基清除能力来选择抗氧化剂具有重要意义。由于羟基自由基氧化反应具有一定累积性，随着反应时间的变化其吸光度值呈现一定的变化趋势，反应1h左右基本趋于稳定，因此，实验中选择了1h的反应时间。BHT和芦丁作为对照（因芦丁的质量浓度范围非常窄，为避免曲线重叠，图3中没有表示芦丁曲线），雪菊不同溶剂提取物清除羟基自由基的曲线见图3。

图3 雪菊不同提取物清除羟基自由基的清除率Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging rate of different extractions of C.tinctoria

由于超临界CO2浸膏不溶于羟基自由基的测定体系，因此未评价该浸膏对羟基自由基的清除率。由图3可知，样品清除羟基自由基的能力为：体积分数为50%乙醇提取物>体积分数为95%乙醇提取物>丙酮提取物。3种提取物中以体积分数为50%乙醇提取物对羟基自由基的清除能力最强，但清除效果弱于对照品BHT。

羟基自由基的清除能力通常用清除体系中的50%羟自由基的半数清除率值EC50来表示。EC50值越小，则样品清除羟基自由基能力越强，芦丁和BHT作为对照，样品及对照品清除羟基自由基的半数清除率见表3。

表3 雪菊不同溶剂提取物清除羟基自由基的半数清除率（EC50值）Table 3 Half hydroxyl free radical scavenging ratio(EC50)of different extractions ofC.tinctoria

由表3可知，样品的半数清除率EC50值均明显高于对照品BHT和芦丁，说明上述提取物对羟基自由基的清除能力要弱于对照品对羟基自由基的清除能力。

3 结论

对天山雪菊的超临界CO2浸膏、体积分数分别为50%、95%乙醇提取物和丙酮提取物的体外抗氧化活性的对比研究表明，4种提取物均具有比较强的清除DPPH自由基的能力，其中体积分数为50%的乙醇提取物清除活性高于体积分数为95%的提取物清除活性，明显高于丙酮提取物和超临界CO2浸膏，与提取物中所含总多酚和总黄酮呈明显的正相关关系。对羟基自由基的清除活性也表明，体积分数为50%的乙醇提取物清除活性也高于体积分数为95%的乙醇提取物及丙酮提取物。清除DPPH自由基的能力和羟基自由基的能力强弱顺序一致，均为体积分数为50%乙醇提取物清除能力最强。实验结果表明，雪菊中总黄酮以极性较强的黄酮苷类为主，提取其中的总黄酮和总多酚类物质应选择体积分数为50%的乙醇提取可获得具有更强抗氧化活性的组分。

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Antioxidant activity of different solvent extracts fromCoreopsis tinctoria

LIU Boao,LIU Jiguo,LIU Wei,PAN Xiaobo,QI Ying,Liu Yumei*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urmuqi 830046,China)

To compare the antioxidant activity of different solvent extracts fromCoreopsis tinctoria,theC.tinctoriasample was extracted by supercritical CO2extraction,and then the residue was extracted by acetone,followed by 95%ethanol and 50%ethanol,respectively.Four kinds ofC.tinctoriasolvent extracts were obtained and the antioxidant activity was evaluated.The DPPH free radical scavenging activity and hydroxyl radical scavenging activity were evaluated and the content of flavonoids and polyphenols were analyzed for comparison.The results showed that all those extracts had strong antioxidant activity on DPPH free radicals,but all lower than the activities of butylated hydroxytoluene(BHT),trolox,α-tocopherol and vitamin C.The antioxidant activity of extracts on hydroxyl free radical was lower than rutin and BHT.Among the extracts,the one extracted by 50% ethanol had the highest antioxidant activity on DPPH free radicals;however,the one extracted by supercritical CO2extraction had the lowest activity. In addition,the one extracted by 50%ethanol had the highest antioxidant activity on hydroxyl free radicals,and the one extracted by acetone had the lowest activity.

Coreopsis tinctoria;antioxidant activity;flavonoids;polyphenols;hydroxyl radicals;DPPH radicals

R285.5

A

0254-5071（2014）03-0071-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.018

2014-01-17

国家自然科学基金资助项目（31360403）；新疆大学本科生科研实践训练项目（XJU-SRT-09041）

刘博奥（1992-），男，本科生，研究方向为应用化学。

*通讯作者：刘玉梅（1965-），女，教授级高工，博士，研究方向为食品功能因子。