奶山羊AGPAT6基因多态性与生长性状的关联分析

常振华颜伟俊王韦华何成孟晓静

（1.渭南职业技术学院，陕西 渭南 714000；2.渭南市畜牧技术推广中心3.蒲城县地方公路站）

奶山羊AGPAT6基因多态性与生长性状的关联分析

常振华1颜伟俊1王韦华1何成2孟晓静3

（1.渭南职业技术学院，陕西 渭南 714000；2.渭南市畜牧技术推广中心3.蒲城县地方公路站）

利用PCR-RFLP技术对549只西农萨能和关中奶山羊群的AGPAT6基因遗传多态性与生长性状（体高、体长和胸围）的相关性进行了研究。结果表明AGPAT6基因存在4个SNPs多态：P1、P2、P4与P10位点分别位于5'UTR（g.152G>C）、内含子2（g.8124G＞A）、外显子4（g.9263C>G）和3'UTR（g.16436G>A）。经关联分析，P2、P4和P10三位点在西农萨能奶山羊和关中奶山羊品种中都属于中度多态，4个SNPs的不同基因型对两个奶山羊品种的生长性状影响均不显著（P>0.05）。

奶山羊；AGPAT6基因；多态性；生长性状；关联分析

萨能奶山羊和关中奶山羊是著名的乳用山羊品种，以体格高大、产奶量高、适应性强和遗传稳定而著称。AGPAT，即磷酸甘油酰基转移酶，也叫做溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)[1]。AGPAT能催化甘油三酯sn-2位置的酯化[2,3]，而甘油三酯是乳脂和体脂的主要成分，它能催化溶血磷脂酸形成磷脂酸[4]。目前研究发现，AGPAT可能有8种异构体,其中AGPAT6基因等多个基因的mRNA表达上调基因网络参与乳脂合成和分泌[5]。在国内，昝林森等就AGPAT6基因对不同品系的荷斯坦奶牛乳脂率和奶产量有过研究[6]，但目前尚未有AGPAT6遗传多样性对生长性状(体高、体长、胸围）影响的相关报道。为此，本研究采用PCR-RFLP技术分析了西农萨能奶山羊和关中奶山羊群体AGPAT6基因遗传多态性及其对生长性状的影响，旨在为奶山羊的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验动物

本试验采用颈静脉法采血分别采集西农萨能奶山羊268份来自陕西省千阳县西农萨能奶山羊种羊场（202只）和西北农林科技大学种羊场（66只）；关中奶山羊血样281份来自陕西省三原县关中奶山羊种羊场，共计549份。每个个体采集10mL，加ACD抗凝剂带回实验室，-20℃冷冻存备用；同时现场测量并记录了549头奶山羊的体尺指标，其中包括体长(BL)、体高(BH)和胸围(CC)。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取与AGPAT6基因引物。本实验参照Chen[7]的方法奶提取山羊的血样基因组DNA。所用到的引物全部参照GeneBank中提供的牛的AGPAT6基因序列（NC_007328.3），用Primer premier5.0软件自行设计，如表1所示。

表1 AGPAT6基因所用引物信息和退火温度bp,℃

1.2.2AGPAT6基因PCR-RFLP反应条件。以奶山羊的混合DNA池（每10个不同样本混合成一个DNA池）做模板进行基因的PCR扩增。PCR扩增反应总体系如下：Taq DNA聚合酶0.4 μL、10×PCR Buffer 2.7μL、dNTPs 2.0μL、上游引物（F）0.5μL、下游引物(R)0.5μL、DNA模板（10ng/μL）1.0μL和超纯水17.9μL，总体积是25μL。PCR扩增反应程序为：95℃预变性4min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸40s，循环次数33，72℃延伸10min，4℃保存。利用PCR-RFLP技术对发现的SNPs进行分型。PCR-RFLP技术的具体方法为：将10×Buffer缓冲液1.0 μL、PCR产物5.0 μL、超纯水3.5μL、限制性内切酶（10u/μL）0.5μL混合，合计10μL。根据限制性内切酶说明书中的反应温度水浴8h，用3%的琼脂糖电泳、成像，然后进行基因型分析。

1.3数据统计与分析

根据突变位点的基因分型结果，对测得的基因型进行统计，计算多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度等群体遗传参数。SPSS16.0用来计算基因型和奶山羊经济性状之间的关系，基因型与生长性状关联分析中用到的模型为：Y ij(性状值)=μ (群体均值)+Ai(年龄的固定效应)+Gj(基因型的固定效应)+eij(随机误差)。

2 结果与分析

2.1奶山羊AGPAT6基因多态性

通过对549只西农萨能奶山羊和关中奶山羊的AGPAT6基因全部外显子和部分5'UTR和3'UTR进行分析，经DNA池测序发现4个突变位点（P1，P2，P4，P10）：分别为5'UTR（g.152G>C）、内含子2（g.8124G>A）、外显子4（g.9263C>G）（见图1）和3'UTR（g.16436G>A），其中外显子4处突变引起苏氨酸的一个同义突变，而5'UTR、内含子2和3'UTR不进行编码蛋白，未引起氨基酸突变。

图1 AGPAT6基因P4基因座CG型测序结果

本实验采用PCR-RFLP和测序的方法去检测已发现的4个多态位点。利用限制性内切酶KpnI（引入酶切位点）对P1位点（g.152 G>C）的PCR产物（175bp）进行分型，结果在两个奶山羊品种中都检测到了GG型、GC型和CC型三种基因型。利用限制性内切酶EcoRΙΙ对发现的P2位点(g.8124G> A)的PCR产物(372bp)进行分型，结果在两个奶山羊品种中都检测到了GG型、GA型和AA型三种基因型。利用限制性内切酶NcoΙ对发现的P4位点(g. 9263C>G)的PCR产物（241bp）进行分型，在两个奶山羊品种中都检测到了CC型、CG型和GG型三种基因型。最后，利用限制性内切酶BglΙ对P10位点（g.16436G>A）的PCR产物（336bp）进行分型，在两个奶山羊品种中都检测到了GG型、GA型和AA型三种基因型。群体遗传学统计分析结果表明：P2、P4和P10三位点在西农萨能奶山羊和关中奶山羊品种中多态信息含量都属于中度多态（表2）。2.2奶山羊AGPAT6基因多态性与生长性状的关联性分析

表2 P1、P2、P4和P10多态信息含量

SNPs与生长性状关联分析表明：4个SNPs（P1、P2、P4（见表3）和P10）的不同基因型对两个奶山羊品种的生长性状影响均不显著（P>0.05）。

表3 萨能和关中奶山羊AGPAT6-P4基因座不同基因型与生长性状的相关分析

3 讨论与结论

AGPAT6在调节甘油三酯的合成过程中起着关键作用[8]。对人类的研究发现，通过超表达AGPAT6酶可以增加细胞中溶血磷脂酸和磷脂酸水平[9]。在小鼠上的报道显示，缺失AGPAT6基因的小鼠在泌乳期会出现乳腺导管和乳腺上皮细胞中乳脂肪滴的大小和数量都显著下降[10]。因此，AGPAT6是影响产奶性状的一个关键基因，而为了完善这个基因的功能，我们试图探索这个基因与奶山羊的生长性状的关系。

本研究通过对549只西农萨能奶山羊和关中奶山羊的AGPAT6基因全部外显子和部分5'UTR和3'UTR进行分析，经DNA池测序发现了4个突变位点（P1、P2、P4与P10），通过关联性分析发现P1、P2、P4和P10多态位点与两个奶山羊品种的生长性状均不相关（P>0.05）。因此，虽然在西农萨能和关中奶山羊品种中发现了AGPAT6基因的4个突变位点，但是它们对这两个品种的生长性状影响均不显著，这一结论可以为以后奶山羊的育种提供一定的参考依据。

[1]Schmidt J A,Yvone G M,Brown W J.Membrane topology of human AGPAT3(LPAAT3)[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.2010,397(4):661～667.

[2]Mistry D H,Depeters E J,Medrano J F.Comparative composition of total and sn-2 fatty acids in bovine and ovine milk fat [J].Lait.2002,82:255～259.

[3]Ye G M,Chen C,Huang S,et al.Cloning and characterization a novel human 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase gene AGPAT7[J].DNA Sequence-The Journal of Sequencing and Mapping,2005,16:386～390.

[4]Aben I F,Degano L,Calza F,et al.Milk quality and automatic milking:fat globule size,natural creaming,and lipolysis[J]. Journal of Dairy Science,2005,88:3519～3529.

[5]Bionaz M,Loor JJ.ACSL1,AGPAT6,FABP3,LPIN1,and SLC27A6 are the most abundant isoforms in bovine mammary tissue and their expression is affected by stage of lactation[J].J Nutr,2008a,138(6):1019～1024.

[6]昝林森,张佳兰,刘新武.牛AGPAT6基因遗传特征与奶牛产奶性能相关性研究[M].北京:中国农业科学,2007,40(7): 1498～1503.

[7]Chen H,Leibenguth F.Studies onmultilocus finger-prints, RAPDmarkers and mitochondrial DNA of agynogenetic fish( carassiusauratusgibelio)[J].Bio-chemGenet,1995,33:297～306.

[8]Thering B J,Graugnard D E,Piantoni P,et al.Adipose tissue lipogenic gene networks due to lipid feeding and milk fat depression in lactating cows[J].Journal of Dairy Science,2009,9: 4290～4300.

[9]Chen Y Q,Kuo M S,Li S,et al.AGPAT6 is a novel microsomal glycerol-3-phosphate acyltransferase[J].J Biol Chem, 2008,283:10048～10057.

[10]Vergnes L,Beigneux A P,Davis R,et al.Agpat6 deficiency causes subdermal lipodystrophy and resistance to obesity[J]. Journal of Lipid Research,2006,47:745～754.

1004-2342（2014）03-0009-02

S813.3

B

2014-03-31）

渭南职业技术学院青年科研基金（WZYQ201215）。

常振华（1984～)，女，内蒙古乌兰察布市人，硕士，助教，主要从事牛、羊生产及育种工作。