藏药二十一味寒水石丸中的总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量测定

朱林燕, 孔子铭, 谢建峰, 韩泳平

(西南民族大学少数民族药物研究所, 成都 610041)

藏药二十一味寒水石丸中的总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量测定

朱林燕, 孔子铭, 谢建峰, 韩泳平

(西南民族大学少数民族药物研究所, 成都 610041)

目的: 建立二十一味寒水石丸中总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量测定方法.方法: 以干酪素作为吸附剂, 碱性条件下显色, 以磷钼钨酸为氧化剂, 用紫外可见分光光度法测定鞣质含量; 采用HPLC法同时测定没食子酸和鞣花酸的含量. 使用迪马Diamonsil-2 C18(4.6 mm×250mm, 5µm)色谱柱, 以乙腈--0.1磷酸水梯度洗脱, 体积流量分别为1.0mL/min, 柱温为30℃; 检测波长270nm, 测定.结果: 以没食子酸计的鞣质含量在0.5～5μg·ml-1的范围内线性关系良好(r＝0.9991), 平均回收率为95.77%, RSD为0.70%(n＝6); 没食子酸在0.32～1.6μg范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为98.70%, RSD为1.01%(n=9), 鞣花酸在0.372～.1.86μg范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为99.63%, RSD为0.75%(n=9).结论: 本方法准确、可靠简便, 具有较强专属性, 可用于常用藏药二十一味寒水石丸中总鞣质、没食子酸和鞣花酸的含量测定.

二十一味寒水石丸; 干酪素法; 总鞣质; 没食子酸; 鞣花酸

二十一味寒水石丸为藏医临床常用药, 用于培根木布病即胃溃疡等胃肠道疾病的治疗[1], 是由寒水石、渣驯膏、波棱瓜子、止泻木子、木瓜、紫檀香、石榴子、豆蔻子、牛黄、甘青青兰、莲座虎耳草、绿绒蒿、余甘子、榜嘎、沙棘膏、荜菝、獐牙菜、藏木香、塞北紫堇、木香、诃子等21味药材组成. 处方中诃子和余甘子等药材中富含鞣质类成分,一方面具有收敛止血等多方面功效[2],另一方面还有沉淀蛋白或凝集蛋白等作用[3],此外, 还通过对酶发生作用凝固微生物体内原生质, 表现出抑制病毒和细菌的生长等活性[4-6]. 鞣质的水解产物包括没食子酸和鞣花酸, 也有有着重要的生理功能[7],鞣质及其水解产物都是复方治疗胃病的活性组分, 因此, 准确测定地测定二十一味寒水石丸中没食子酸和鞣花酸的含量[8-10],能为该制剂的质量控制和开发应用提供更全面的科学依据. 同时本文还采用干酪素法建立了测定二十一味寒水石丸中总鞣质含量的[11]方法, 为二十一味寒水石丸的质量标准的控制提供了依据.

1 仪器与试剂

Waters2695型高效液相色谱仪; 2996 PDA检测器; KQ-250B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); METTLER TOLEDO AE240电子分析天平[梅特勒一托利多仪器(上海) 有限公司]; 紫外分光光度计, 没食子酸对照品(批号110831-200803, 中国食品药品检定研究院), 鞣花酸(购自上海中药标准化研究中心, 批号08-2005)干酪素(成都市科龙化工试剂厂, 化学纯, ), 所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外, 其余为分析纯, 去离子水, 乐百氏水, 磷钼钨酸试液自制. 二十一味寒水石丸(由阿坝藏族羌族自治州藏医院提供, 批号：20130401、20130402、20130403).

2 总鞣质的含量测定

2.1 测定波长的选择

通过扫描, 发现总酚、不被吸附的酚和没食子酸对照品试液都在760nm处有吸收, 故确定实验测定波长为760nm.

2.2 磷钼钨酸溶液

取钼酸钠2.5g和钨酸钠10g, 加水70ml使其溶解, 再加盐酸10ml、磷酸5ml, 加热回流10小时, 自然冷却,加硫酸锂15g、水5ml和溴0.02ml, 并煮沸除去残留的溴(大约是15min), 冷却, 加水稀释到100ml, 滤过, 得磷钼钨酸自制溶液. 本液不能显绿色 (若放置的溶液过后变为绿色, 可加溴0.02ml, 可以煮沸除去多余的溴).

2.3 干酪素用量选择

对干酪素的用量的选择, 目的是评价鞣质沉淀的效率. 即分别取0.2g、0.4g、0.6g、0.8g和1.0g的干酪素去沉淀同样重量的样品. 当干酪素重量为0.6g时,测定的鞣质的含量趋于稳定, 不被吸附的多酚含量不再继续减少,据此说明鞣质已经被干酪素完全吸附. 由此确定干酪素的用量是0.6g.

2.4 对照品溶液的制备

精密称取25 mg没食子酸对照品, 放置于100mL棕色容量瓶中, 加入少量水溶解, 摇匀, 稀释至刻度, 并精密量取5mL, 置于50mL棕色量瓶中, 摇匀, 用水稀释至刻度, 即得0.025mg/mL 没食子酸对照品溶液.

2.5 线性关系的考察

分别取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0 mL, 置于25 mL 棕色容量瓶中, 并分别磷钼钨酸溶液各1mL, 然后向各个棕色容量瓶中加水分别为11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7 mL, 并用29%碳酸钠试液稀释到刻度, 定容, 摇均匀, 并放置30分钟, 配制相应的空白试液, 依据紫外-可见分光光度法, 在760nm处测定吸光度的值. 以质量浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标, 得标准曲线方程为A＝0.1154C-0.0157, r＝0.9991, 表示没食子酸在0.5～5μg/mL有良好的线性关系.

2.6 样品中鞣质含量的测定

2.6.1 供试品的制备

取二十一味寒水石丸, 粉碎, 精密称定1.00g, , 置250mL棕色量瓶中, 加入去离子水150mL, 浸置30min,超声30 min, 冷却, 加去离子水稀释到刻度, 摇均匀, 静置并使试液中固体沉淀,过滤, 去掉50mL初滤液, 精密取续滤液20mL 于100mL棕色容量瓶中, 加水定容到刻度, 摇匀, 即得供试品溶液.

2.6.2 总酚含量测定

精密量取供试品试液2mL, 置25mL棕色容量瓶中, 按“2.6”项下的方法操作(加入磷钼钨酸1mL, 加水10mL,用29%碳酸钠溶液稀释至刻度, 摇匀, 放置30 min), 测定吸光度值, 根据标准曲线计算出供试品试液中没食子酸的含量, 并由此计算供试品溶液中总酚的量.

2.6.3 不被吸附的多酚的测定

取供试品溶液25mL, 加到已经放有0.6g干酪素的250mL锥形瓶中,密塞,放置于水浴锅中(30℃)恒定温度1h,经常振摇, 取出, 自然冷却, 摇匀, 过滤, 弃掉初始滤液, 精密取续滤液2mL, 置25mL棕色容量瓶中, 按“2.6”项下的方法操作(加入磷钼钨酸1mL, 加水10mL, 用 29%碳酸钠溶液稀释至刻度, 摇匀, 放置30min), 在760nm处依法测定吸光度值, 利用标准曲线计算出供试品溶液以没食子酸量, 并由此计算出不被吸附的多酚的量.

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验

精密吸取6份对照品溶液2ml, 按照“2.6”的方法操作测定, 计算RSD为0.6%, 说明此方法精密度好.

2.7.2 稳定性试验

取供试品溶液, 按“2.6”项下方法操作, 分别于0、1、2、3、4、5、6h测定鞣质的含量, 结果表明, 6h内鞣质平均量为0.66%, RSD为1.2%. 由此可得出结论, 样品中在6h内基本稳定.

2.7.3 重现性试验

精密称定同一批号的样品细粉1.0g, 共 6份, 按“2.6”项下操作, 测得二十一味寒水石丸中总鞣质的平均量为 3.52%, RSD为1.23%. 说明此实验方法重现性良好.

2.7.4 加样回收试验

精密取已知含量的样品细粉1.0g, 一共6份, 分别精密加入没食子酸对照品的量为10.0mg, 并按 “2.6”项下方法操作, 计算回收率. 结果测定平均回收率为95.77%, RSD为0.70%.

2.8 样品测定

取3批二十一味寒水石丸(批号 130401、130402、130403), 分别按“2.6”项下方法测定, 结果总鞣质的质量分数分别为 3.53 %、 3.52%、3.57% (n＝3) .

3 没食子酸和鞣花酸的含量测定

3.1 色谱条件

色谱条件C18色谱柱(4.6mm×250mm); 洗脱程序见表1; 检测波长270nm; 流速为1.0mL/min; 柱温30℃; 进样体积10μL.

表1 梯度洗脱程序表Tab 1 Gradient elution program

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备

并分别精密称取鞣花酸对照品18.6mg、没食子酸对照品16mg, 置于100ml的容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀得没食子酸和鞣花酸的混合对照品溶液(鞣花酸、没食子酸分别为为0.186mg·ml-1、0.16mg·ml-1).

3.2.2 供试品溶液的制备

精密称取本品2.0g, 置100mL具塞锥形瓶中, 用50%甲醇50mL溶解, 并称定重量. 超声提取30min, 自然冷却, 称重, 用50%溶剂补足失重, 并摇匀, 滤过, 弃去初滤液, 取续滤液, 即得没食子酸、鞣花酸含量测定溶液.

3.3 系统适应性试验

3.3.1 系统适用性实验

分别取供试品溶液、含没食子酸和鞣花酸的混合对照品溶液各10μL, 注入高效液相色谱仪, 并按“3.1”色谱条件进行分析, 没食子酸在8.1min左右出峰, 鞣花酸在40.1min左右出峰, 峰型尖锐、对称, 结果在与理论板数按没食子酸和鞣花酸计算均不低于3000, 没食子酸和鞣花酸与相邻峰的分离度大于1.5. 见图1：

3.4 线性关系考察

精密称取没食子酸和鞣花酸混合对照品溶液2, 4, 6, 8, 10ml置于10ml的容量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 分别取10μL注入高效液相色谱仪. 以峰面积和浓度进行线性回归, 得回归方程, 见表2.

3.5 精密度试验

按“3.3”项下操作,取没食子酸、鞣花酸混合对照品溶液10μL, 分别连续进样5次, 测得没食子酸、鞣花酸峰

面积的RSD分别为0.78%, 0.89%, 结果表明精密度良好.

3.6 稳定性试验

取供试品溶液液, 室温放置, 分别在0、4、8、10、12h取样10µL在高效液相色谱仪上进样, 记录峰面积, 计算没食子酸及鞣花酸RSD分别为0.15%、0.56%.

3.7 重复性试验

图1 供试品品以及没食子酸、鞣花酸混合对照溶液的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference of gallic acid, ellagic acid and sample

表2线性关系Tab.2 Linear correlation

精密称取样品5份, 按“3.2.2”项下方法制备供试品溶液, 在高效液相色谱仪上以10µL进样, 记录峰面积,并计算质量分数. 结果没食子酸、鞣花酸的平均质量分数分别为2.16mg.g-1、2.8474mg.g-1; RSD分别为0.12%、0.24%, 结果表明重现性良好.

3.8 加样回收率试验

精密称取已测没食子酸、鞣花酸的二十一味寒水石丸(20130401)粉末9份, 每份样品约2.0g, 测没食子酸时,每三份各分别精密加入混合对照品溶液(含没食子酸、鞣花酸分别为0.16mg·ml-1、0.186mg·ml-1,)22ml、27mL、

32mL, 测鞣花酸时, 每三份各精密加入混合对照品溶液分别为24.5L、30mL、36.5mL; 按上述“3.2.2”项下制备方法和“3.1”色谱条件, 制备加样回收供试品溶液, 注入高效液相色谱仪,进行测定分析, 计算回收率.结果见表3.

表3 加样回收率试验(n=9)Tab.3 Result of recovery tests (n=9)

4 样品测定

取3批样品, 按3.3项下方法测定峰面积, 每份平行测定3次, 根据标准曲线法计算没食子酸、鞣花酸的质量浓度, 结果见表4.

表4 没食子酸、鞣花酸含量的测定(n=3)Tab.4 Determination result of samples(n=3)

5 讨论

5.1 鞣质含量测定讨论

根据2010版《中国药典》(一部)附录XB鞣质含量测定, 该实验用没食子酸作为对照品, 鞣质属于多酚类物质, 通过对磷钼钨酸的还原反应, 生成蓝色的络合物, 吸收光强度与酚含量存在正相关的关系, 采用紫外分光光度计法测定鞣质含量. 此方法较原来2000版《中国药典》皮粉重量法准确, 在专属性和测定精密度方面都有了提高. 此外, 本法采用水提取鞣质, 再以干酪素沉淀非鞣质类成分, 两者之差即为鞣质含量. 考虑到在鞣质含量测定过程中, 需避光操作, 加之滤纸对鞣质有一定的吸附,故在供试品溶液的制备过程中, 需弃去初滤液, 取续滤液, 以防止含量偏低.

5.2 提取溶剂的选择

本研究曾对 30%甲醇超声、50%甲醇超提取、提取70%甲醇超声提取, 以及提取时间、温度等提取方式和提取条件进行考察, 结果表明提取条件定为50%甲醇在超声提取30min的条件下提取率较为稳定, 为最佳实验条件.

5.3 流动相的选择

本文刚开始采用的是等度洗脱, 分离效果不佳. 后来与相关文献[12]进行比较、试验, 结果发现, 乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱法的效果更好. 经过多次调整乙腈-水的配比, 选择了本文的洗脱程序作为流动相, 能更好的将对照峰与杂质峰分开, 分离度和拖尾因子均符合2010年版《中国药典》要求, 且峰形更好干扰较小.

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Determination of total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill

ZHU Lin-yan, KONG Zi-ming, XIE Jian-feng, HAN Yong-ping
(Ethnic Pharmaceutical Institute of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Objective:To establish a stable method for determination of total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill.Methods:The UV-vis method was used to determine the content of total tannins of Ershiyiwei Hanshuishi pill with casein as sorbent, phosphorus molybdenum-tungsten acid as oxidant. Gallic acid and ellagic acid were determined by HPLC. The Diamonsil-2 C18column(4.6 mm×250 mm, 5µm) column was used with gradient elution. Mobile phase was composed of acetonitrile-0.1% phosphoric acid in solution, and the flow rate was 1 mL/min．The column temperature was kept at 25 ℃.The detection wavelength was set at 270 nm. Results: The linear relationship of standard curve was good within the range of 0.5—5μg/mL, r = 0.9991,and the average recovery was 95.77% with RSD of 0.70% (n=6). The linear range of gallic acid was 0.32～1.6μg(r=0.9999), and the average recovery rate was 98.70%, with RSD of 1.01%. The linear range of ellagic acid was 0.372～1.86μg(r=0.9999), the average recovery rate was 99.63% with RSD of 0.75% respectively.Conclusion:The method is accurate, reliable, specific and can be used to determine the total tannins, gallic acid and ellagic acid in Ershiyiwei Hanshuishi pill .

Ershiyiwei Hanshuishi pill; casein method; total tannins; gallic acid; ellagic acid

R284; R29

: A

: 1003-4271(2014)03-0388-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.11

2014-03-025

韩泳平(1965-), 男, 四川成都人, 教授, 硕士生导师. E-mail: yphan65@tom.com.

科技部十二五支撑计划资助(2012BAI27B07); 西南民族大学研究生创新项目资助(CX2014SP262)