蚯蚓抗菌肽的研究进展

杜明亮，李成会

（唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

生物科学与技术研究

蚯蚓抗菌肽的研究进展

杜明亮，李成会

（唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

蚯蚓抗菌肽是近年来发现的新一代抗菌剂，对蚯蚓的免疫起着重要的作用。对蚯蚓抗菌肽的研究进展、应用现状及前景进行了总结。

蚯蚓；抗菌肽；理化性质；生物活性；研究进展

蚯蚓俗称地龙，又名曲蟮，是环节动物门寡毛纲的代表性动物。蚯蚓是营腐生生活动物，生活在潮湿的环境中，以腐败的有机物为食，生活环境内充满了大量的微生物却极少得病，这与蚯蚓体内独特的抗菌与免疫系统有关。蚯蚓的免疫防御体系由防止异物侵入的外部屏障结构和防止侵入后进一步蔓延的内部免疫机制构成。后者又分为自然免疫和获得性免疫，包括细胞免疫和体液免疫。蚯蚓的获得性免疫并不像高等动物那样发达。而体液免疫中抗菌肽发挥着重要的作用[1]。

抗菌肽（Anti-bacterial peptides）是在诱导的条件下动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是动物免疫防御系统的重要组成部分[2]。对抗菌肽的研究始于1980年代，瑞典科学家G. Boman等人，用阴沟通杆菌和大肠杆菌刺激惜古比天蚕蛹诱导产生具有抗菌活性的物质，从血淋巴分离后得到的抗菌小肽即为天蚕素（Cecropins），这是人类首次发现的真正意义上的抗菌肽[3,4]。随着抗菌肽研究的深入，人们发现抗菌肽广泛分布于动植物和微生物中，这些多肽分子量小，热稳定性高，抗菌谱广，还可以抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，且不易产生抗药性[5]，正是由于抗菌肽具有这么多的作用，所以抗菌肽的研究成为了国内外研究的热点领域之一。

1 蚯蚓抗菌肽的分类

1.1 能溶血的抗菌肽

Alexandra Milochau[6]从蚯蚓体腔液里分离到了两种具有抗菌、溶血和凝血功能的蛋白质，分子量分别为40 ku和45 ku，命名为Fetidins；Beschin[7]也发现了分子量为42 ku的体腔细胞溶解因子（CCF-1），与无脊椎动物体内存在的凝集因子G和革兰氏阴性菌结合蛋白具有同源性，它们均参与无脊椎动物的防御机制，CCF-1具有溶血作用，在蚯蚓抗微生物侵袭方面发挥一定的作用。

1.2 不能溶血的抗菌寡肽

Chao[8]等从蚯蚓Lumbricus rubellus中得到抗菌肽Lumbricus I，体外实验表明具有广谱的抗菌活性，在100 mg·L-1时不具有溶血活性。刘艳琴[9]利用硫酸铵沉淀—超滤—DE52离子交换层析—Sephadex G-10凝胶过滤和C18反相高压液相五个步骤从蚯蚓体腔液中分离纯化出一种全新的抗菌寡肽ECP5-1，含有一个半胱氨酸并且无溶血特性。

1.3 具有抑菌作用的金属蛋白

Dhainaut[10]等从N. diversicolor terrestris的体腔液中发现了一种能够抑制大肠杆菌和微球菌的抗菌蛋（MP II），它是一种位于蚯蚓体腔内的G1粒细胞中，且具有抑菌作用的金属蛋白，这种抗菌蛋白可能是竞争微生物生活所需的铁离子而起作用的。对于未免疫的蚯蚓，其抗菌活性非常低，说明细菌免疫可激发强烈的抗菌活性。

1.4 其它抗菌肽

张希春等[11]经硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离和反向快速蛋白质液相色谱（FPLC）分析，得到了两种新的抗菌肽F-1与F-2，经电喷雾离子源质谱（ESI-MS）测定，其相对分子质量为535.27和519.27。另外张希春等[12]同样用硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离得到了一种蚯蚓抗菌肽EABP-1，该肽的最大紫外吸收在277.16 nm，精确的分子量没有确定。崔东波等[13]以本地产蚯蚓为原料采用磷酸缓冲溶液浸提，硫酸铵沉淀，经过Sephadex G-100层析，Sephadex G-50和Sephadex G-25分离和抗菌活性筛选得到了一种相对分子量为5 500的抗菌活性肽。

2 蚯蚓抗菌肽的理化性质

天然的抗菌肽通常是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，含有4个或4个以上带正电荷的氨基酸如赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg），N端亲水，C端疏水，且具有双亲性质。水溶性好，分子量大约为4 KD。大部分抗菌肽具有热稳定性性，在100 ℃加热10-15 min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特性，对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性[14]。

例如郑津辉等[15]对提取的蚯蚓抗菌肽进行热处理（37 ℃、50 ℃、80 ℃）和pH值处理（4.0、7.0、9.0），证实蚯蚓具有较好的热稳定性和pH稳定性。赵晓瑜等[16]研究表明蚯蚓的抗菌29肽在pH为2.2或11的环境中抑菌活性不变，而且在煮沸10 min后仍能保留80%以上的活性，证实其稳定性强。

3 蚯蚓抗菌肽的生物活性

孙振钧[17]等首次提出并验证了蚯蚓抗病的两个假设：（1）肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分；（2）蚯蚓抗菌肽（蛋白）可以诱导获得并具有非专一性的免疫应答。刘艳琴[18]等利用细胞病变抑制法测定了蚯蚓寡肽的体外抗伪狂犬病毒（PRV）的作用，分别用AO/EB染色法和DNA琼脂糖凝胶电泳法测定了蚯蚓寡肽对HeLa细胞凋亡的影响。结果显示，蚯蚓寡肽可以抑制PRV感染细胞，同时存在剂量效应和时间效应。崔东波[13]提取出来的一种抗菌肽对金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德菌、食酸丛毛单胞菌、恶臭假单孢菌、皮氏伯克霍尔德菌、酵母菌、白色念球菌均有不同程度的抑制。在沸水中加热1 h，抑菌活性未见显著变化，表现出较高的热稳定性。张希春[12]等提取出来的蚯蚓抗菌肽EABP-1，最小抑菌浓度实验表明，EABP-1对鹑鸡肠球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动菌、土生克雷伯菌的最小抑菌浓度为11.4 μg·mL-1，对粪肠球菌的最小抑菌浓度为22.8 μg·mL-1，对真菌白色念珠菌没有表现出完全的抑制作用。郑津辉等[19]用30%-80%不同浓度的硫酸铵沉淀蚯蚓蛋白，用考马斯亮蓝测定蛋白含量，采用管碟法和微量稀释法分别测定蚯蚓抗菌肽和苯甲酸钠在pH值分别是4.0、7.0、9.0下的抑菌活性及最小抑菌浓度（MIC）。结果显示40 %、50 %、60 %、70 %硫酸铵沉淀出的蛋白都表现出抗菌活性，并对G+金黄色葡萄球菌和G-大肠杆菌均有抑菌性。而张希春等[11]提取出来的两种新抗菌肽F-1的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser, F-2的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr，最小抑菌浓度实验表明F-1与F-2对鹑鸡肠球菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌、土生克雷伯氏菌的最小抑菌浓度分别为11.4 mg·L-1和12.85 mg·L-1，对粪肠球菌的最小抑菌浓度分别为22.8 mg·L-1和25.68 mg·L-1，对真菌白色念珠菌没有表现出完全的抑制作用。赵晓瑜等[16]等采用菌落计数法对蚯蚓抗菌29肽的最低抑制浓度进行了研究，研究结果表明：该抗菌肽具有广谱性，即不仅有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见细菌，而且还能够抑制酿酒酵母、露湿漆斑菌、总状毛霉等真菌，当质量浓度为0.009 g·L-1时对大肠杆菌就有明显的抑制效果。刘兵[20]提取的抗菌肽也对绿脓杆菌和黄曲霉产生了不同程度的抑制作用。李曾夏子[21]对蚯蚓的体液进行超滤-阳离子交换分离-凝胶过滤层析提取出的3-30KD的抗菌肽经实验证明对巴氏杆菌有较好的抑制作用。

4 蚯蚓抗菌肽的应用现状及展望

抗生素不仅会增加细菌耐药性，而且会对人类健康产生危害。而抗菌肽则是直接和细菌的细胞壁、细胞膜或者胞质内的靶目标作用，不需要和受体结合，所以细菌很难产生抗药性。面对当今社会抗生素的滥用已经导致大量细菌产生了极强的抗药性的问题，抗菌肽的发现无疑给了人们希望。

目前，含有蚯蚓抗菌肽的产品已研究开发出来，并在动物养殖中进行了初步应用，具有抗病保健和诱食的作用，使动物免疫力增加，改善肉质等作用。但因提纯技术有限，应用的产品多为粗品。随着科学技术的迅速发展和人们对蚯蚓抗菌肽研究的不断深入，蚯蚓抗菌肽在不久的将来会在医药卫生和畜牧兽医方面发挥更重要的作用。

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[19] 郑津辉,孟庆恒,王景安.蚯蚓抗菌肽的提取与抗菌活性研究[J].食品研究与开发,2008,29(10):51-53.

[20] 刘兵.蚯蚓抗菌肽提取纯化及其性质研究[D].贵州:贵州大学,2008.

[21] 李曾夏子.3-30KD蚯蚓抗菌肽的分离纯化及其抗菌效果的研究[D].湖南:湖南农业大学,2010.

（责任编辑、校对：李春香）

Progress in Antimicrobial Peptides of Earthworm

DU Ming-liang, LI Cheng-hui
(Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China)

Antimicrobial Peptides of the earthworm is a new antimicrobial agent discovered in recent years. It plays an extremely important roal on the earthworm’s immune system. we review the advance on investigation of antimicrobial peptides in recent years, and prospect the development trend of the antimicrobial peptides.

earthworm; antimicrobial peptides; physicochemical property; biological activity; research advance

Q959.193

A

1009-9115(2014)02-0049-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2014.02.014

唐山师范学院平台建设项目（11PT-03）

2013-07-04

杜明亮（1991-），男，河北唐山人，研究方向为动物营养。

李成会（1972-），男，河北廊坊人，硕士，教授，研究方向为动物营养研究及饲料资源开发。