鹿科动物线粒体DNA概述及分子进化研究进展

邵元臣，刘华淼，张然然，邢秀梅※

(1．江苏科技大学，江苏 镇江 212000； 2．中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

1857年，瑞士生理学家Rudolf Albert在动物肌肉细胞中发现了线粒体；1962年，Nass发现，线粒体能够进行自我复制、转录、表达以及调控。线粒体DNA记录了生物由单细胞到多细胞、由低等生物到高等生物进化过程的历史信息。线粒体DNA属于小分子，全序列比较容易获得。因此，可以通过对线粒体DNA序列的比较分析来研究物种的起源与进化[1]。

1 鹿科动物线粒体DNA结构特点

鹿科动物线粒体DNA属环状共价闭合双链DNA，相对分子量较小，长度一般在14.8Kb～18.1Kb之间，大部分在16.3Kb左右，核酸序列相对保守，是单拷贝的母系遗传大分子。线粒体DNA序列分为编码区和非编码区，其中，编码区包括37个编码基因(13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因)，非编码区是D-loop区[2]。动物线粒体DNA是由1条重链(H)和1条轻链(L)2条链构成，其中轻链上有8个tRNA编码基因和ND6基因，其余大部分编码基因均在H链上[3]。

2 鹿科动物线粒体DNA基因组成成分

鹿科动物线粒体包含13个蛋白质编码基因，分别是3个细胞色素氧化酶亚基基因(COⅠ、COⅡ、COⅢ)、7个氧化还原酶亚基基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6)、2个三磷酸腺苷酶亚基基因(ATP6、ATP8)和1个细胞色素CYTB基因。13个蛋白编码基因均为线粒体内膜呼吸链组成成分。通过不同动物间线粒体DNA全序列比对分析，COⅡ、COⅢ基因最保守，且同源性高，而ATP6、ATP8和ND基因之间变异相对较大。其中，ATP6/ATP8、ATP6/ COⅢ、ND4L/ND4、ND5/ND6基因之间紧密相连，有的彼此重叠，并且大多数动物mtDNA的蛋白质编码基因都由tRNA基因间隔。线粒体DNA具有自身特定的密码子系统，与核基因组不同。线粒体DNA中密码子UGA不用来作为终止信号，而是色氨酸密码子；AGA、AGG是线粒体中的终止密码子，而不是精氨酸密码子。

2.1 线粒体tRNA基因

鹿科动物线粒体DNA中共包括22个tRNA基因，其中tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Glu、tRNA-Pro均位于轻链(L)上，其余的tRNA由重链(H)编码。线粒体中tRNA基因的二级结构都以碱基互补配对折叠而形成的三叶草形式存在，包括5bp～7bp核酸形成的氨基酸臂、3bp～4bp核酸形成的双氢尿嘧啶(DHU)臂、3bp～5bp核酸形成的TΨU臂和4bp～5bp核酸形成的反密码子臂以及大小可变的一个额外环。

2.2 线粒体rRNA基因

线粒体DNA中包括2个rRNA基因，分别是12SrRNA和16SrRNA。12SrRNA是线粒体DNA中的小亚基单位，在重链(H)上，位于tRNA-Phe和tRNA-Val基因之间；16SrRNA是线粒体DNA中的大亚基单位，同样位于重链(H)上，并以tRNA-Val间隔。12SrRNA与16SrRNA以单拷贝的形式存在，无间隔区，且核DNA中无拷贝。根据线粒体DNA中的rRNA的序列和结构特点，12SrRNA与16SrRNA基因的进化速率与线粒体DNA基因组的平均进化速率相同，被广泛应用于系统发育研究。另外，12SrRNA和16SrRNA 2级结构包括4个结构域，其中1结构域、2结构域比3结构域、4结构域保守。核糖体RNA基因保守的2级结构保证了与mRNA和tRNA一起完成蛋白质的合成，保证生命活动的正常运行[4，5]。

2.3 线粒体DNA中包含两个非编码区

线粒体DNA中包含2个非编码区即WANCY区和控制区(displacement-loop region)。WANCY是一段位于L链上的复制起始区，起始长度约为30bp～50bp，在tRNA-Asn和tRNA-Cys之间，并且该段可折叠成茎环结构。WANCY区是一段极为保守的区域；控制区即D-loop区是位于D-环区的tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之间，长度大约在1000bp左右，是线粒体DNA中长度和序列变化最大的区域，同时D-loop也包含保守区域。

3 鹿科动物线粒体DNA遗传特点

3.1 线粒体DNA遵循严格的母系遗传方式

相同母系祖先的子代都具有相同的线粒体DNA类型，实际研究中虽不能完全不受外来公畜杂交改良影响，但这种概率较低，在线粒体DNA遗传过程中基因重组现象也较少，因此，采集少量样本就能够对群体遗传结构和特征进行全面分析[6]。

3.2 线粒体DNA与核DNA相比进化速率快

线粒体DNA为环状DNA分子，直接裸露无核蛋白保护，导致发生自然突变的几率较高。负责线粒体DNA复制的γ酶无校对和修复能力，不能对碱基错配及时纠正。线粒体DNA代与代之间扩增时间相对较短，使得积累碱基突变的机会增多，特别是在D-loop区，由于是非编码区，选择压力相对较小，容易积累突变，其碱基替换率比线粒体DNA其他区域要高约5倍～10倍。

3.3 线粒体DNA的异质性

线粒体DNA的异质性是指同一个体线粒体DNA分子的多态性。异质性分为长度异质和位点异质2种。DNA长度异质性主要有同聚物核苷酸数目差异、串联重复序列拷贝数差异和分子结构中部分重复或缺失区域差异3种类型。近年来，有关哺乳动物D-loop区异质性的研究发现，D-loop控制区存在数目和大小各异的串联重复序列。

4 鹿科动物线粒体DNA与鹿科动物分子系统进化研究概况

随着线粒体DNA研究的不断深入，根据线粒体DNA母系遗传、进化速度快和无组织特异性等特点[7]。鹿科动物系统进化研究大都集中于D-loop区、CYTB基因、12SRNA和16SRNA基因。

4.1 D-LOOP区

2001年，Randi E等[8]通过对线粒体DNA控制区分析推断了25种鹿亚科动物的系统进化关系，认为与当前部分种群分类不一致，其中，将梅花鹿分为日本梅花鹿、大陆梅花鹿以及台湾梅花鹿，麋鹿与鹿属动物相近，应合并入鹿属，扁角鹿与波斯黄占鹿属于不同鹿种。并提出将梅花鹿亚种控制区中的重复结构拷贝数作为亚种判断标记。

2006年，吴华等[9]为了探讨我国圈养梅花鹿种群是否可以作为东北梅花鹿野外放归资源，测定了9个圈养品种的45只梅花鹿线粒体DNA控制区的部分序列，分析了我国圈养梅花鹿遗传结构和种群遗传多样性发现，圈养梅花鹿种群遗传多样性丰富，种群之间无显著遗传分化。由此，东北地区圈养梅花鹿可作为野外放归项目资源群。

2009年于浩等通过测定线粒体DNA控制区分析伊河马鹿的起源与分子进化研究发现，马鹿种群间的超异分化程度不高，分化时间相对较近。从构建系统进化树来看，越南梅花鹿是最为古老的亚洲品种，而后是台湾梅花鹿、东北梅花鹿。日本梅花鹿是由东北梅花鹿演变而来，日本梅花鹿与马鹿亲缘关系较近；中国甘肃马鹿与阿拉善马鹿是最古老的马鹿品种，伊河马鹿是亚洲类群向欧洲类群过渡的亚种，近而进化到美洲马鹿类群，从而实现马鹿由中东向美洲演变的过程。

梅花鹿的分化适应了南亚气候，马鹿在亚洲出现，并经历地理迁徙，最终形成美洲和亚洲类群，因此，伊河马鹿可能是亚洲类群向欧洲、美洲过渡形成的。

2012年，涂剑锋等[10]测定了13种鹿亚科动物线粒体DNA的D-loop区全序列，并结合GenBanK数据库中12种鹿科动物同源序列分析来研究鹿科动物的分类和系统进化。25种鹿科动物线粒体D-loop区全长为914bp～1072bp，个体差异在0.1%～12.2%之间，4个种属差异在8.0%～12.2%之间。通过构建系统进化树分析得到，马鹿分化的2个不同种群、麋鹿属的麋鹿、斑鹿属的豚鹿和黄占鹿属的黄占鹿与鹿属分化处于属间差异，并认为应将其并入鹿属，其中，坡鹿是鹿属中的最原始种。

2013年，李秋燕等[11]对新疆塔河马鹿、阿尔泰马鹿、伊河马鹿、阿拉善马鹿、甘肃马鹿5个群体共108个个体的D-loop进行序列扩增，检测出40个单倍型，并构建了NJ和MP分子系统进化树。结果发现，塔河马鹿与其他马鹿遗传距离较远，分属于不同的类群；阿尔泰马鹿、伊河马鹿及甘肃马鹿之间都存在基因交流情况，可能是由于群体间引种杂交所致。并得出新疆马鹿遗传多样性丰富、新疆塔河马鹿可能起源于欧洲、其他马鹿起源于亚洲、部分群体间存在基因交流情况的结论。

4.2 CYTB基因

2008年，张丽[12]根据鹿科动物线粒体DNA cytb基因，探讨白唇鹿、甘肃马鹿、青海马鹿、伊河马鹿、东北马鹿和塔河马鹿的遗传结构和系统进化分析发现，塔河马鹿与甘肃马鹿、青海马鹿亲缘关系最远；塔河马鹿与东北马鹿、伊河马鹿亲缘关系较近；伊河马鹿与甘肃马鹿、青海马鹿亲缘关系较近，与东北马鹿亲缘关系较远；甘肃马鹿和青海马鹿为相同DNA类型；白唇鹿、塔河马鹿与伊河马鹿的遗传多样性丰富，而甘肃马鹿、青海马鹿、东北马鹿遗传多样性相对较贫乏。

2008年，Jose Mauricio等[13]通过线粒体CYTB基因研究美国南部鹿科动物系统分类关系和进化史发现，美国南部鹿科动物起源于上新世，并至少分为8个类群，但随着地理环境的变化和迁徙，逐渐进化并形成目前形态学上的分类。

2008年，王洪亮等[14]测定了塔河马鹿、阿尔泰马鹿、伊河马鹿3个亚种共38个个体CYTB基因的1140bp的序列，分析了核酸序列差异，并通过构建NJ和MP系统进化树分析得到塔河马鹿和阿尔泰马鹿、伊河马鹿遗传距离较远，塔河马鹿与伊河马鹿有部分单倍型与其他亚种聚为一类，并认为塔河马鹿与阿尔泰马鹿、伊河马鹿属于不同类群；塔河马鹿与伊河马鹿受到外种入侵，怀疑是由于引种杂交所致。

2009年，L Partis等[15]分析了欧洲39个地区马鹿线粒体DNA的D-loop控制区和CYTB基因，通过构建系统进化树和networks网络关系图来分析欧洲马鹿系统进化关系和遗传多样性。结果表明，欧洲马鹿分为3个类群，分别是欧洲西部类群、欧洲东部类群和地中海(撒丁岛、西班牙和非洲)类群。并通过计算分化时间发现，3个类群是由更新世时期开始分离。西部类群和东部类群起源于伊比利亚和巴尔干半岛，而第3个类群可能起源于撒丁岛和非洲地区。

2011年，Anna Stankovic，Karolina Doan等[16]对来自于乌克兰克里米亚半岛的晚更新世马鹿进行系统进化分析。从当地博物馆中的乌克兰克里米亚马鹿骨头获得DNA，并扩增线粒体DNA的CYTB基因，来分析与其他鹿科动物的进化关系。通过与网上已经登录鹿科动物序列构建系统进化树分析得到，全世界的马鹿主要分为3个类群，即西部马鹿、东部马鹿与中部马鹿。乌克兰克里米亚马鹿属于欧洲东北部的伊比利亚半岛地区。

2012年，M.Barancekova.J.Krojerova-Prokesova等[17]测定了捷克梅花鹿线粒体DNA的CYTB基因和D-loop控制区，探讨捷克梅花鹿系统进化关系。结果表明，捷克梅花鹿起源于日本半岛和俄罗斯远东地区，捷克梅花鹿的遗传多样性低于日本梅花鹿，高于俄罗斯梅花鹿亚种。

4.3 12SRNA

2005年，M.V.Kuznetsova等[18]通过分析家养鹿与其他几种偶蹄动物的16SrRNA和12SrRNA序列，来研究其分子系统进化关系。结果表明，鹿科动物分为鹿属和麂属，狍属、獐属与驼鹿属，驯鹿属、骡鹿属3个部分。

2006年，LI Bo等[19]测定梅花鹿和马鹿线粒体DNA 12SrRNA基因387bp片段和CYTB基因402bp片段的序列来研究梅花鹿与马鹿的系统发生和核酸距离。通过这2个基因的分析结果均表明，梅花鹿和马鹿是相同的类群，均起源于梅花鹿。

4.4 16SRNA

2010年，刘忠权[20]测定獐线粒体DNA中的16SrRNA基因，从Genbank中获得鹿科动物14种线粒体16SrRNA基因的全序列。通过构建系统进化树分析鹿科动物系统进化发生关系与獐亚科的关系。结果表明，鹿科分为鹿亚科、麂亚科、獐亚科和美洲鹿亚科；獐和美洲鹿亚科狍共同组成獐亚科；毛冠鹿的分类还不确定。

4.5 其他基因

2010年，Daiming Zha等[21]基于tRNA-Val基因与16SrRNA基因设计梅花鹿、东北马鹿、塔河马鹿、赤鹿、驯鹿和牛的特异性引物，通过建立多重PCR方法，最终得到了一种简单、快捷、成本低廉的检测方法，能够从鹿科动物和普通家养动物中进行各类鹿产品的分子检测。

5 展望

在鹿科动物线粒体DNA应用进展方面，种群起源进化和遗传多样性是研究热点。但目前关于茸鹿资源mtDNA的研究只涉及D-loop区、16SrRNA基因，并且其研究也只限于有限的几个资源，部分资源mtDNA的研究一直处于空白状态。为了排除单个基因可能存在种内多态性缺陷及有限序列在统计学上的偏差，应该利用mtDNA的全序列针对我国特有鹿科动物资源，全面分析起源进化和系统发育关系，从分子遗传学角度探讨鹿科动物群体遗传结构和种群特征的差异，系统分析中国鹿科动物与世界鹿类资源系统发育关系。

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